海珠益肝加味方对免疫性肝损伤小鼠细胞因子的影响

徐建良张云城盛国光黄育华△

1.湖北省中医院肝病科（湖北 武汉，430061） 2.湖北省中医药研究院 3.深圳市龙岗区中医院

海珠益肝加味方对免疫性肝损伤小鼠细胞因子的影响

徐建良1，2张云城2盛国光1，2黄育华1，2△

1.湖北省中医院肝病科（湖北 武汉，430061） 2.湖北省中医药研究院 3.深圳市龙岗区中医院

目的：观察海珠益肝加味方对刀豆球蛋白A（Con A）诱导建立的免疫性肝损伤小鼠细胞因子IL-4、IL-6、INF-γ、TNF-a的影响，探讨其作用机制。方法：将40只昆明小鼠随机分为正常组、模型组、醋酸强的松组、海珠益肝加味方组，采用尾静脉注射Con A建立免疫性肝损伤小鼠模型，眼球取血，检测小鼠血清IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α的水平。结果：与正常组比较，模型组小鼠外周血IL-4、IL-6水平明显降低（P＜0.01），IFN-γ、TNF-α水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，醋酸强的松组、海珠益肝加味方组小鼠外周血IL-4、IL-6的水平明显升高（P＜0.01），IFN-γ、TNF-α水平显著降低（P＜0.05）。结论：海珠益肝加味方能升高免疫性肝损伤小鼠细胞因子IL-6、IL-4的分泌水平，降低IFN-γ、TNF-α的水平，恢复Th1/Th2细胞之间的平衡，具有保护肝细胞的作用，可能是其作用机制之一。

海珠益肝加味方；刀豆蛋白A；免疫性肝损伤；细胞因子

慢性乙型肝炎（CHB）是由HBV感染引起的免疫性疾病，导致肝脏损伤的发病机制至今仍未完全清楚。Con A诱导的免疫性肝损伤小鼠模型具有肝脏特异性、剂量依赖性和制作简便快捷的特点［1］，被认为是最适合研究人类病毒性肝炎病理机制的研究模型。海珠益肝加味方是盛国光教授治疗CHB的经验方，在前期的临床及实验研究中，发现其具有抑制乙肝病毒复制、恢复肝功能、抗肝纤维化等作用［2，3］。我们从免疫性肝损伤的角度，观察海珠益肝加味方对免疫性肝损伤小鼠细胞因子的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明小鼠40只，清洁级，5周龄，雄性，体重18～22g，购自湖北省实验动物研究所。

1.2 主要药物及试剂 海珠益肝加味方药物组成：叶下珠、海藻、太子参、枸杞子、白花蛇舌草各15g，茯苓12g，白芥子10g，莪术6g，均购自湖北省中药材公司。按处方加水煎煮两次，混合药液，沉淀过滤，水浴浓缩为含生药1g/ml的药液，分装、灭菌、低温保存，由湖北省中医院制剂室提供。醋酸强的松片由浙江仙琚制药股份有限公司生产（批准文号：H33021207），以生理盐水溶解成0.78mg/ml溶液；Con A购自Sigma公司（批号80M7680V）；IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-a试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 主要仪器 纯水仪（AJC-0501-P），微型旋涡混合器（WH-2），水浴锅（TL-420D），酶标仪（RT-2100C）等。

1.4 动物分组及处理 将40只昆明小鼠随机分为正常对照组、模型组、醋酸强的松组、海珠益肝加味方组，每组10只。各组小鼠适应性饲养两天后，除正常对照组外，其余组小鼠于实验第1天尾静脉注射Con A 20mg/kg（0.9%的生理盐水稀释，浓度为2mg/ml）。并于第1天开始灌胃给药，醋酸强的松组以醋酸强的松7.8mg/kg灌胃、海珠益肝加味方组以海珠益肝加味方13.4ml/kg灌胃，正常组、模型组以蒸馏水0.2m l/10g灌胃，每天1次，连续3天。末次灌胃给药后4h，模型组、醋酸强的松组、海珠益肝加味方组一次性尾静脉注射Con A20mg/kg［4，5］。8h后，摘眼球取血，室温静置2h，低温离心留取血清。

1.5 IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α含量的测定。采用ELISA法检测小鼠外周血血清中IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α的含量。

1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行数据统计分析。实验数据均以（±s）表示，计量资料组间比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有显著性意义。

2 结果

2.1 各组小鼠外周血血清IL－4、IL－6的水平 见表1。

表1 各组小鼠外周血血清IL－4、IL－6水平（±s）

表1 各组小鼠外周血血清IL－4、IL－6水平（±s）

与正常组比较，**P＜0.01；与模型比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别 n IL－4（pg/ml） IL－6（pg/ml ）10 66.74±8.73 29.25±9.78模型组 10 55.54±5.81** 11.25±7.54**强的松组 10 62.74±6.17▲▲ 50.25±11.23▲▲海珠益肝加味方组 10 63.42±6.33▲ 25.13±11.33正常组▲

2.2 各组小鼠外周血血清IFN-γ、TNF-a的水平 见表2。

表2 各组小鼠外周血血清IFN－γ、TNF－α水平（±s）

表2 各组小鼠外周血血清IFN－γ、TNF－α水平（±s）

与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别 n IFN－γ（pg/ml） TNF－a（pg/ml ）10 2.98±0.99 68.38±8.82模型组 10 4.43±0.79** 81.25±6.15**强的松组 10 3.07±0.49▲▲ 68.13±14.80▲海珠益肝加味方组 10 2.88±1.64▲ 58.00±3.05正常组▲▲

3 讨论

在免疫应答过程中，经典的T细胞为辅助性T细胞，它的功能是有效控制免疫反应的发生，尽可能地降低机体的损害，不同的细胞因子环境导致Th0分化不同。IFN-γ、TNF-α诱导Th0向Th1分化，IL-4、IL-6、IL-10诱导Th0向Th2分化，细胞因子（CK）在其中发挥了重大作用。Th1型CK如干扰素-γ（IFN-γ）通过激活效应细胞的细胞毒及吞噬功能发挥作用。Th2型CK如白细胞介素-4（IL-4、IL-6、IL-10），主要辅助B细胞产生抗体，并决定产生抗体的同种型。Th1/Th2极化是免疫应答调节中的关键环节。Th1/Th2之间失去平衡会引起细胞免疫功能紊乱，从而导致疾病的发生。

辛永宁等［6］发现Th1型细胞因子上调与乙型肝炎病毒感染时肝脏的炎症活动密切相关，在病情的急性期和慢性活动期，Th1型细胞因子分泌是明显占优势的，IL-2、IFN-γ分泌增多，促进细胞免疫，有利于病毒清除，但同时可加重肝脏损伤；在慢性携带状态和稳定期，Th2型细胞因子分泌为主，IL-4、IL-6、IL-10分泌增多，Th1型细胞免疫应答相对低下，导致HBV长期持续感染，病情进展成慢性化。

IL-4是一种由活化的T细胞产生的细胞因子，以往称为B细胞生长因子，同时也活化细胞毒性T细胞，被认为是典型的由Th2细胞产生的细胞因子，对炎症性细胞因子的释放和这些细胞的杀菌活性有明显抑制作用［7］。IL-6为多效的细胞因子，生理功能复杂，既有促炎作用，又有抗凋亡作用。Sun R［8］研究表明IL－6对各种肝损伤包括T细胞介导的肝炎有保护作用，其保护机制可能是IL－6能诱导抗凋亡蛋白的产生。IFN-γ被认为是Th1反应因子，可增加单核细胞的吞噬和吞饮作用，刺激细胞释放氧化因子和TNF-α，杀灭肿瘤细胞或受病毒感染的靶细胞。TNF-α能诱导多种蛋白质的表达，如TNF-α活化巨噬细胞，能诱导IFN-γ等细胞因子产生，而IFN-γ能增强TNF-α的活性。

海珠益肝方由叶下珠、海藻、茯苓等六味中药组成，前期研究提示对免疫性肝损伤小鼠神经－内分泌－免疫网络有干预作用［9］。海珠益肝加味方在海珠益肝方基础上加用太子参、枸杞子组成，是盛国光教授治疗CHB的经验方，具有解毒、化痰、消瘀、补虚的功效［10］。本研究发现，海珠益肝加味方可降低血清中TNF-α的水平，提示该药对Con A引起小鼠肝损伤的保护作用与抑制促炎细胞因子表达密切相关。同时观察到，模型组小鼠注射Con A后IFN-γ水平明显上升，IL-4、IL-6水平明显下降，引起细胞免疫功能亢进，体液免疫功能低下。海珠益肝加味方组IFN-γ明显下降，同时IL-4、IL-6明显上升，提示海珠益肝加味方可以恢复Th1/Th2细胞比例的平衡，稳定免疫功能，预防、减轻免疫性肝损伤，具有保护肝细胞的作用。

［1]曲建慧，张修礼.ConA性小鼠肝损伤模型的研究及应用［J］.肝脏，2001，6（3）：180－181.

［2]盛国光，黄育华，张建军，等.海珠益肝胶囊治疗慢性乙型肝炎近期疗效观察［J］.中国中西医结合杂志，2002，22（2）：136－137.

［3]谭大琦，李秋华，竺稽能，等.海珠益肝胶囊对免疫性肝损伤的影响［J］.中西医结合肝病杂志，2002，12（2）：36－38.

［4]李跃华，朱丽，哈团柱，等.刀豆素A诱导小鼠肝损伤增加肝脏NFKB活性［J］.中华肝脏病杂志，2003，11（2）：115.

［5]Filinonov PN，Sukhenko TG，Pulitonopulo AN，etal.Level of liver fibrosis and immune status ofmice of different age after heroii treatment and long abstinence［J］.Bull Exp BiolMed，2005，140（6）：723－725.

［6]辛永宁，宣世英，孙樱.慢性乙型肝炎Th1/Th2细胞的免疫功能研究进展［J］.临床肝胆病杂志，2005，21（6）：182－184.

［7]刘巧丽，高月求.刀豆球蛋白A诱导小鼠免疫性肝损伤的凋亡机制研究.中国免疫学杂志［J］.2008；24（10）：876－878.

［8]Sun R，Tian ZG，Kulkarni S，et al.IL－6 prevents T cell-mediated hepatitis via inhibition of NKT cells in CD4＋T cell-and STAT3－dependentmanners.J Immunol，2004，172（9）：5648－5655.

［9]黄育华，晏雪生，彭亚琴，等.海珠益肝胶囊对免疫肝损伤小鼠神经肽SPVIP及辅助性T细胞亚群的影响［J］.中华中医药学刊，2007，25（11）：2267－2269.

［10]盛国光，黄育华，李晓东，等.慢性乙型肝炎中医辨治规律探讨［J］，中西医结合肝病杂志，2012，22（6）：382.

Effect of Haizhu Yigan Jiawei formula on Cell Factor in Immunity Hepatic lnjury m ice

XU Jian-liang1，ZHANG Yun-cheng2，HUANG Yu-hua△，etal.Department of Liver Diseases，Hubei Hospital of TCM（Wuhan Hubei，430061）China

Objective：To observe the effectof Haizhu Yigan Jiawei formula on cell factor of IL-4，IL-6，INF-γ，TNF-αin immunity hepatic injurymice.M ethods：Forty kun mingmice were random ly divided into normal control group，model group，prednisone group，HZYGJWF group，by Con A tail vein injectionsmade immune liver injurymodel.after taking blood through eye sockets，measuring the level of IL-4，IL-6，INF-｜γ，TNF-α.Results：Compared with normal control group，the level of IL-4 and IL-6 in Model group mice were decreased（P＜0.01），the level of IFN-γand TNF-a inmodel group micewere increased（P＜0.05）；Compared withmodel group，the level of IL-｜4 and IL-6 in prednisone group，HZYGJWF group mice were obviousiy heightened（P＜0.01），the level of IFN-｜γand TNF-a in model group mice were obviousiy reduced（P＜0.05）.Conclusion：Haizhu Yigan Jiawei formula can heighten the level of IL-4 and IL-6 in Immunity Hepatic lnjury Mice，reducethe level of IFN-γand TNF-a，and can adjust the balance between Th1/Th2，can protect liver，may be one of themechanisms

Haizhu Yigan Jiawei formula；Con A；Immunity Hepatic lnjury；Cell factor

2016－10－16 编辑：黄育华）

10.3969/j.issn.1005－0264.2017.03.015

△通讯作者