QuEChERS- 超高效液相色谱- 串联质谱法快速测定草莓中2，4- 表芸苔素内酯残留量

虞 冰，刘 莉，汪志威，齐沛沛，王新全，徐霞红，王祥云(.金华市农产品质量综合监督检测中心，浙江 金华 3000； .省部共建国家重点实验室培育基地浙江省植物有害生物防控重点实验室农业部农药残留检测重点实验室 浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江 杭州 300)

QuEChERS- 超高效液相色谱- 串联质谱法快速测定草莓中2，4- 表芸苔素内酯残留量

虞 冰1，刘 莉1，汪志威2*，齐沛沛2，王新全2，徐霞红2，王祥云2
(1.金华市农产品质量综合监督检测中心，浙江 金华 321000； 2.省部共建国家重点实验室培育基地浙江省植物有害生物防控重点实验室农业部农药残留检测重点实验室 浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021)

建立了超高效液相色谱- 三重四极杆串联质谱测定草莓中2，4- 表芸苔素内酯残留量的方法。基于QuEChERS方法进行了净化材料及其配比的优化，最终采用40 mg PSA 和40 mg C18的组合进行净化。试验结果表明，2，4- 表芸苔素内酯在2.5～1 000 μg·L-1内线性良好，相关系数为0.999，其最低检出限为5 μg·kg-1，定量限为20 μg·kg-1。在20、50、100和200 μg·kg-1添加水平下，对草莓空白样品添加2，4- 表芸苔素内酯，方法回收率为98.1%～110%，相对标准偏差为3.3%～5.4%，满足农药残留分析方法的要求。应用本方法对市售的47个草莓样品进行检测，均为未检出2，4- 表芸苔素内酯残留。

2,4- 表芸苔素内酯； 超高效液相色谱- 三重四极杆串联质谱； 草莓； 植物生长调节剂

1970年，Mitchell[1]首先从油菜花粉中提取到可促进植物生长的活性物质，命名为Brassins(芸苔素内酯)，之后又有50余种天然芸苔素内酯类化合物(brassinolide)及其类似物激素从大量物种的花、种子、根茎和叶中被分离出来，被统称为芸苔素甾醇(brassinosteroids，BRs)。在芸苔素甾醇植物激素中，芸苔素内酯类化合物因其活性最高而被广泛应用于农业生产[2]。目前我国已登记的芸苔素内酯主要有4种[3]，分别为2，4- 表芸苔素内酯、22，23，24- 表芸苔素内酯、28- 高芸苔素内酯和28- 表高芸苔素内酯。其中，2，4- 表芸苔素内酯由于合成所需工业原料麦角甾醇易得，因此应用更为广泛[4]。

草莓以其香味诱人、口感甜美、具有药用价值以及高经济价值的特点而广受青睐[5]。2，4- 芸苔素内酯的使用有助于提高草莓产量[6]，现已有相关产品获得登记[7]。目前对芸苔素内酯类化合物报道的检测方法包括气相色谱- 质谱法[8- 9]、高效液相色谱- 电化学检测器[10]/荧光[11]/质谱法[12]。其中，气相色谱- 质谱法主要用于鉴定，其灵敏度较差；而高效液相色谱- 电化学检测器/荧光/质谱法主要采用苯硼酸、菲硼酸、萘硼酸、二茂铁硼酸、9- 菲硼酸和2- 溴吡啶- 5- 硼酸等硼酸衍生试剂[11- 14]提高芸苔素内酯的仪器响应值，确保灵敏度，但衍生过程前处理方法较为繁琐，且衍生试剂通常活性较高难以长期保存。本试验拟基于QuEChERs方法，结合超高效液相色谱- 三重四极杆质谱建立草莓中2，4- 表芸苔素内酯残留量的快速检测方法，并对实际样品进行检测验证。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

采用超高效液相色谱仪LC- 30A(日本Shimadzu公司)和三重四极杆质谱联用仪AB- SCIEX 4500(美国AB公司)；Masslynx 4.1软件用于仪器控制、数据采集和结果分析。色谱柱为Waters T3柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；台式离心机(美国Thermo公司)；Filter Unit滤膜(0.22 μm，Agela Technologies公司)。

甲醇、乙腈(色谱纯，美国Merck公司)；乙酸铵、甲酸(HPLC级，美国Tedia公司)；氯化钠、无水硫酸镁等均为分析纯，购自华东医药有限公司；PSA、C18、GCB净化材料均购于Agela Technologies公司。

1.2 样品前处理方法

萃取。称取草莓样品10.00 g(0.01 g)于50 mL离心管中，准确加入10 mL乙腈，涡旋1 min。加入1 g氯化钠和4 g无水硫酸镁，涡旋1 min，在7 000 r·min-1条件下离心3 min，取上清液待净化。

净化。移取上清液1.5 mL于2 mL离心管中，加入40 mg PSA+40 mg C18，剧烈震荡1 min后，在7 000 r·min-1条件下离心3 min，准确吸取上清液0.5 mL至装有0.5 mL水的2 mL离心管中，混匀，以0.22 μm滤膜过滤，待超高效液相色谱串联质谱(UPLC- MS/MS)测定。

1.3 仪器分析方法

采用UPLC- MS/MS进行样品中2，4- 表芸苔素内酯的分析测定。色谱柱为Waters T3柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流动相为水和甲醇(1∶9，V/V)，其中水相含2 mmol·L-1乙酸铵和甲醇中含0.1%甲酸；流速为0.25 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量5 μL。

质谱条件。采用电喷雾离子源，多反应监测模式(MRM)，加热温度500 ℃，喷雾电压5 500 V。该化合物的特征离子对有4对，其母离子- 子离子对及相应的碰撞能量和去簇电压经方法优化后条件见表1，表中标注*子离子为定量离子。

表1 2，4- 表芸苔素内酯的UPLC- MS/MS离子对及碰撞能量、去簇电压

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

本试验基于三重四极杆串联质谱仪确立2，4- 表芸苔素内酯的质谱条件，主要包括离子对选择、碰撞能量和去簇电压等参数优化。配制1.0 mg·L-12，4- 表芸苔素内酯标准溶液，通过蠕动泵以7 μL·min-1的流速直接进入质谱进行分析。首先，在Q1 MS模式下，m/z为300～600的质量范围内进行全扫描，结果发现，其母离子[M+H]+的质核比m/z为481.4。然后，在Product模式下，以481.4为母离子筛选子离子，在0～40 eV内，改变碰撞电压获得响应值较高的子离子依次为315.2，349.3，445.2和113.0。最后，在MRM模式下优化每对离子对的碰撞能量和去簇电压(表1)。图1展示了50 μg·L-12，4- 表芸苔素内酯标准溶液经色谱- 质谱分析后得到的4对离子对的提取离子流色谱图，响应值较高的离子对依次为481.4>315.2和481.4>445.2。通过分析草莓基质标准溶液也验证这两对离子对具有最高的响应值和较低的干扰，确定以481.4>315.2为定量离子，481.4>445.2为定性离子。

图1 50 μg·L-1芸苔素内酯标准溶液4组离子对的特征

2.2 样品净化材料的选择和优化

QuEChERS[15]方法是近年来发展十分迅速的一种前处理方法，该方法的重要环节在于除杂吸附剂的选择。本试验首先开展了4种吸附剂组合，即PSA+C18、PSA+GCB、PSA+GCB+C18和GCB+C18，对草莓提取液净化效果的比较。结果表明，当吸附剂使用量各40 mg时，对样品色素的去除效果依次为PSA+C18≈PSA+GCB>PSA+GCB+C18>GCB+C18。同时在空白草莓样品中添加200 μg·kg-1芸苔素内酯后，比较4种吸附剂组合的回收率，结果表明，40 mg PSA+40 mg C18的填料组合净化后芸苔素内酯的回收率最高为103.8%，其余填料组合净化后对芸苔素内酯损失较大，其回收率仅为51.2%～63.7%，故选择以PSA+C18的填料组合作为净化材料。

在选定以PSA和C18组合作为净化材料后，本试验又比较了20、40、60和80 mg等4种不同用量对草莓提取液的净化效果(表2)，20 mg添加水平草莓萃取样品的颜色较红，40、60和80 mg添加量净化效果明显优于20 mg；添加比例为40 mg时，继续增加净化材料比例对样品去色效果不明显。

同时，评价了4档净化材料添加后草莓中2，4- 表芸苔素内酯在200 μg·kg-1的添加回收率，结果显示，回收率在95.3%～111.0%，能满足检测要求。本方法最终以40 mg PSA+40 mg C18作为草莓样品提取液的净化材料。

表2 2，4- 表芸苔素内酯各前处理方法的回收率

2.3 线性、灵敏度、基质效应和方法回收率

配置2.5、5、10、25、50、100、250、500和1 000 μg·L-12，4- 表芸苔素内酯的溶剂标准溶液和草莓基质标准溶液，以定量离子对481.4>315.2响应值对标样浓度绘制标准曲线。试验结果表明，在2.5～1 000 μg·L-1，溶剂标线性拟合方程为Y=2423.8X+10 250，相关系数r为0.999，其中Y为峰面积，X为标准溶液浓度；在2.5～1 000 μg·L-1，基质标线性拟合方程Y=1 866.1X+16 545，相关系数r为0.999。以两组标准曲线拟合方法的斜率比值作为基质效应判定的依据，结果表明，草莓萃取样品经本方法净化后的基质效应为0.77，基质效应表现为抑制，因此采用基质标准溶液外标法进行定量。

该方法对2，4表芸苔素内酯在草莓样品中的最低检出限以3倍信噪比计为5 μg·kg-1，最低定量限以10倍信噪比为20 μg·kg-1。在草莓空白样品中添加适当体积的2，4- 表芸苔素内酯标准溶液，使样品中添加浓度分别为20、50、100和200 μg·kg-1，静置30 min，使药液被草莓样品充分吸附，随后按照1.2节的前处理方法和1.3节的仪器条件进行方法验证，回收率和相对标准偏差见表3。结果表明，本方法对草莓中芸苔素内酯在定量限浓度(20 μg·kg-1)，中等浓度(50和100 μg·kg-1)和高浓度(200 μg·kg-1)的加标回收率在98%～110%，完全满足方法检测需要。

表3 不同添加水平下草莓中2，4- 表芸苔素内酯的回收率和相对标准偏差

2.4 实际样品验证

以本方法对47个市售草莓样品进行检测，均未检出2，4- 表芸苔素内酯残留。

3 小结

本研究建立了草莓样品中2，4- 表芸苔素内酯残留量的QuEChERs- 超高效液相色谱- 串联质谱的快速检测方法。对PSA、C18和GCB等净化材料组合和用量进行了比较优化，最终采用40 mg PSA和40 mg C18作为净化材料组合。本方法前处理简单、灵敏度高，线性范围、准确度和精密度均可满足农药残留检测的要求。

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(责任编辑：张瑞麟)

S668.4

：B

：0528- 9017(2017)09- 1538- 03

2017- 06- 18

国家自然科学基金(21607133)；浙江省公益技术应用研究(2016C32G4010122)

虞 冰(1986—)，女，浙江金华人，助理工程师，本科，从事农产品质量安全检测研究工作，E- mail：563640286@qq.com。

汪志威，助理研究员，博士，从事农药环境行为和残留分析工作，E- mail：wangzhiwei1106@126.com。

文献著录格式：虞冰，刘莉，汪志威，等. QuEChERS- 超高效液相色谱- 串联质谱法快速测定草莓中2，4- 表芸苔素内酯残留量[J].浙江农业科学，2017，58(9)：1538- 1540，1545.

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170912