负压创面治疗术对大鼠脂肪干细胞迁移行为的影响

李晓明，刘 苹，汪 超，杨佳佳，姚仕采，张 波△

(1．第三军医大学大坪医院野战外科研究所，重庆 400042；2．重庆医科大学附属儿童医院PICU/儿童发育疾病研究教育部重点实验室，重庆 400014)

论著·基础研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.25.003

负压创面治疗术对大鼠脂肪干细胞迁移行为的影响

李晓明1，刘 苹1，汪 超2，杨佳佳1，姚仕采2，张 波1△

(1．第三军医大学大坪医院野战外科研究所，重庆 400042；2．重庆医科大学附属儿童医院PICU/儿童发育疾病研究教育部重点实验室，重庆 400014)

目的探讨负压创面治疗术(NPWT)对大鼠脂肪干细胞(ADSCs)迁移行为的影响。方法8头体质量为(20±2) kg巴马小香猪，分别接受假手术(A组，n=16)、持续负压吸引(B组，n=8)和间歇负压吸引(C组，n=8)，治疗72 h后观察3个月。细胞水平观察NPWT对ADSCs迁移行为的影响，提取大鼠ADSCs，采用8 h持续负压吸引和间歇负压作用于ADSCs，Transwell检测ADSCs迁移能力，MTT检测细胞增殖能力，Western blot法检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达。结果B组和C组创面愈合效果明显优于A组；与A组比较，B、C组ADSCs细胞迁移数量差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，而细胞增殖差异均无统计学意义(P>0.05)；HIF-1α表达与ADSCs细胞迁移结果一致。结论NPWT通过上调HIF-1α蛋白表达进而促进大鼠ADSCs迁移。

负压创面治疗术；脂肪干细胞；迁移

创面难愈是目前医学界关注的热点和难点，尤其是糖尿病足、压迫性溃疡等症状，严重影响着人们的健康。负压创面治疗术(negative-pressure wound therapy,NPWT)作为一种加快患者创面愈合的新方法，多应用于难愈性创面的治疗并在临床治疗中取得了很好的疗效，但其作用机制尚不明确[1-2]。脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)具有多向分化潜能、取材方便、来源充足等优点，被称为修复治疗中的“种子细胞”，有研究表明，局部移植ADSCs可有效促进皮肤创面组织修复[3-5]。因此，假设NPWT可通过上调ADSCs迁移，进而促进皮肤创面组织修复，缩短创面愈合时间。本实验主要目的在于观察NPWT对大鼠ADSCs迁移行为的影响，进一步探讨NPWT促进创面愈合的作用机制，以便更好地将NPWT应用于难愈性创面相关疾病的研究及治疗。

1 材料与方法

1.1实验动物 8头巴马小香猪，雌雄不限，体质量(20±2)kg；10只雌性3月龄SD大鼠，体质量(200±20)g。动物由第三军医大学大坪医院野战外科研究所动物实验中心提供，动物使用许可证号：SYXK(渝)2012-0010。

1.2仪器与试剂 仪器主要包括组织匀浆器(德国Miltenyi)，8 MV Precise医用直线加速器(瑞典Elekta)，负压引流仪(山东威高)，低温离心机(美国Thermo)，电泳仪(美国Bio-Rad)，凝胶成像仪(美国Bio-Rad)，核酸蛋白定量仪(美国Thermo)。试剂主要包括BSA(武汉博士德生物)，MTT(美国Hyclone)，结晶紫(成都科龙)，0.4 μm Transwell小室(美国Corning)，蛋白酶抑制剂(美国Roche)，cDNA试剂盒(大连宝生物)，缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α)抗体(北京博奥森)，GAPDH抗体(北京博奥森)，辣根过氧化物酶山羊抗兔(联科生物)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore)，增强型ECL显色液(美国Thermo)，BCA试剂盒(碧云天)。

1.3方法

1.3.1分组及难愈性创面模型制备 小香猪在动物实验前12 h禁食，10 mg/kg氯胺酮快速麻醉，5～10 min后肌内注射0.5 mg/kg地西泮和25 mg/kg阿托品，后续视动物麻醉情况按0.2 g/kg肌内注射追加15 g/L戊巴比妥钠。将小香猪背部剃毛，采用直线加速器照射脊柱两侧4 cm区域，创面照射剂量20 Gy。备皮打孔，形成直径4 cm、深度为0.8 cm皮肤全层缺损。每头小香猪单侧2个创面，共4个创面，一侧作为对照组接受假手术(A组，n=16)，另一侧分别接受120 mm Hg持续负压吸引(B组，n=8)和120 mm Hg间歇负压吸引(C组，n=8)治疗72 h后，观察3个月。

1.3.2ADSCs分离与培养 采用0.5 mL/100 g肌肉注射速眠新对SD大鼠进行麻醉；用剃毛器去除腹股沟表皮毛发，局部消毒，切开皮肤，取皮下脂肪组织；用生理盐水和PBS液冲洗脂肪组织块3次，以洗去血迹；采用组织剪将组织块搅碎，呈糊状；将浓度为0.075%的2～3倍体积Ⅰ型胶原酶加入搅碎的组织块中消化60～90 min；然后用50目的滤网过滤脂肪组织，滤液进行1 000 r/min离心10 min；弃上清液，得到的细胞沉淀用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基溶液重悬；调整细胞浓度为1×105/mL，接种于25 cm2培养瓶中；37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养；24 h后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后根据细胞生长情况，每3天换1次液，待细胞达到80%融合时用 0.25%胰酶消化传代，隔天换液；倒置相差显微镜观察记录培养细胞生长情况。本课题组前期工作已对该方法提取的ADSCs进行了鉴定，因此本文未进行进一步探讨[6]。

1.3.3Transwell迁移实验 将细胞制备成单细胞悬液，计数并调节细胞浓度，将Transwell上室加入20 000个细胞，下室加入含1%血清培养基，使用不同负压模式作用于Transwell小室。在孵箱中静置8 h后，使用棉球轻轻将膜上层未迁移过去的细胞擦掉，倒置晾干；使用0.1%结晶紫室温染色30 min；细胞进行染色后用PBS清洗，晾干；在显微镜下挑选5个视野，拍照并计数。

1.3.4细胞活性检测 将细胞消化计数，按一定密度接种至24孔板中，待细胞贴壁后，去除培养基，使用PBS清洗并加入无血清培养基，置于孵箱内孵育8 h后，将每孔中分别加入60 μL 的MTT溶液，然后置于孵箱中孵育4 h后轻轻吸掉培养基，再在孔中分别加入300 μL DMSO，置于摇床上摇5 min；在490 nm波长下使用酶标仪检测吸光度(A)值。

1.3.5Western blot检测 收集蛋白样品，用BCA试剂盒检测蛋白浓度。蛋白上样量为每孔20 μg，电泳过程中，跑60 V浓缩胶尽量保持1 h以上，110 V分离胶大概所需2.5 h，待溴酚蓝跑至底部后，暂停电泳仪；200 mA下持续100 min电转至PVDF膜上。5% BSA溶液中封闭1 h，TBST洗涤3次，将PVDF膜置于含有HIF-1α(1∶1 000)、GAPDH抗体(1∶1 000)的5% BSA中，4 ℃摇床孵育过夜，次日加入HRP抗体室温孵育2 h，显影。用Image J软件(美国国立卫生研究院)进行灰度分析，结果以目的蛋白与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)平均吸光度值的比值表示。

2 结 果

2.1NPWT对难愈性创面愈合的影响 NPWT治疗难愈性创面72 h后，A组肉芽组织较晦暗，B组和C组肉芽组织鲜红，呈细颗粒状。治疗21 d后A组创面大小未见明显变化，B组和C组创面明显收缩，且C组愈合程度优于B组，见图1。

A1～C1：负压吸引72 h后小香猪创面图；A2～C2：负压吸引21 d后小香猪创面图(A1、A2为对照组，B1、B2为持续负压吸引组，C1、C2为间歇负压吸引组)

图1不同NPWT模式对难愈性创面愈合的影响

2.2NPWT对大鼠ADSCs迁移行为的影响 采用Transwell法检测不同负压创面治疗模式作用ADSCs 8 h后迁移变化情况，结果显示：B组、C组与A组相比，ADSCs细胞迁移数量增加且差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；B组与C组相比差异有统计学意义(P<0.01)，且迁移数量低于C组，见表1、图2。

A：对照组；B：持续负压吸引组；C：间歇负压吸引组

图2不同NPWT模式对大鼠ADSCs迁移行为的影响(×100)

A：对照组；B：持续负压吸引组；C：间歇负压吸引组

图3不同NPWT模式对大鼠ADSCs增殖行为的影响

2.3NPWT对大鼠ADSCs增殖行为的影响 采用MTT法检测不同负压创面治疗模式作用ADSCs 8 h后细胞增殖变化情况，结果显示：B组、C组与A组之间ADSCs细胞增殖差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1、图3。

2.4Western blot检测大鼠ADSCs HIF-1α表达 经与内参GAPDH对比后，B组(0.62±0.09)、C组(1.39±0.27)与A组(0.47±0.07)相比HIF-1α表达增加且差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；B组与C组相比差异有统计学意义(P<0.01)，且HIF-1α表达低于C组，见图4。

表1 不同NPWT模式对大鼠ADSCs迁移、增殖行为的影响

a：P<0.05，b：P<0.01，与A组比较；c：P<0.01，与C组比较

A：对照组；B：持续负压吸引组；C：间歇负压吸引组

图4 HIF-1α在ADSCs中的表达

3 讨 论

NPWT是近年来创立并开展的创面治疗新方法，被广泛应用于各种急性或慢性复杂难愈性创面，我国最早由裘华德教授引进并改良后应用于骨科和普通外科患者。NPWT可避免化学药物治疗可能引起的不良反应，较常规开放式换药，具有创面愈合快、感染率低、更换敷料次数少等优点，但其促进创面愈合的确切作用机制尚未完全清楚[1,7]。NPWT可分为持续负压吸引、间歇负压吸引及变压负压吸引，目前临床常采用持续负压吸引，这种治疗模式的优点是简单方便、易操作，而欧美负压创伤治疗学会的基础理论研究显示：间歇负压吸引更加有利于肉芽组织再生，加速创伤愈合过程，本研究采用不同负压吸引模式治疗结果显示，间歇负压吸引组创面愈合效果明显优于对照组和持续负压吸引组，这与同类型研究结果相吻合[8-9]。

ADSCs作为一种存在于人或动物不同部位脂肪组织中的“种子细胞”，可明显加快全程皮肤组织切除后的创面愈合及糖尿病创面等难愈创面的修复，此外，ADSCs在创面局部微环境下可以诱导分化为创面修复所必需的成纤维细胞、血管内皮细胞和角质层细胞[10-11]。尽管ADSCs在创面愈合过程中发挥着极其重要的作用，但ADSCs异体或自体移植仍面临生物安全性等诸多问题，且该细胞的迁移能力差，因此寻找合适的方式提高ADSCs的迁移能力和修复功能显得至关重要[10]。HIF-1α是缺氧环境密切相关的蛋白，其介导的缺氧信号传导是调节细胞迁移的重要机制，相关研究证实HIF-1α蛋白表达变化与ADSCs细胞迁移能力关系密切[12]，而NPWT能诱导HIF-1α表达上调[13]，由此推断NPWT可通过增加HIF-1α蛋白水平表达促进ADSCs迁移，进而加速皮肤创面组织修复，缩短创面愈合时间。

本研究通过采用持续负压吸引和间歇负压吸引两种不同NPWT模式治疗小香猪难愈性创面，发现不同负压吸引模式在创面愈合过程中存在着差异，且间歇负压吸引更加有利于创面组织修复。进一步研究发现持续负压吸引组、间歇负压吸引组与对照组相比ADSCs细胞迁移数量增加，且间歇负压吸引组优于持续负压吸引组；为排除因细胞增殖而导致的迁移差异，采用MTT观察迁移过程中ADSCs生物活性，结果显示持续、间歇负压吸引均对ADSCs细胞增殖无显著影响。分析负压吸引后蛋白表达变化发现，间歇负压吸引可增加HIF-1α蛋白水平表达，以往有研究证实，HIF-1α受氧分压的调控，能在缺氧条件下稳定表达[14]。

综上所述，本研究揭示了NPWT通过上调HIF-1α蛋白水平表达，诱导ADSCs细胞迁移，进而调控创面修复。NPWT促进ADSCs细胞迁移可能成为创面修复潜在治疗靶点，为NPWT用于难愈性创面治疗的深入研究提供理论依据。

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Effectofnegative-pressurewoundtherapyonadipose-derivedstemcellsmigrationbehavior*

LiXiaoming1,LiuPing1,WangChao2,YangJiajia1,YaoShicai2,ZhangBo1△

(1．InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042;2．PediatricIntensiveCareUnitAffiliatedChildren′sHospitalofChongqingMedicalUniversity/KeyLaboratoryofChildDevelopmentalDiseases,MinistryofEducation,Chongqing400014,China)

ObjectiveTo investigate the effect of negative-pressure wound therapy (NPWT) on the migration behavior of rat adipose-derived stem cells (ADSCs).MethodsEight(20±2)kg Bama miniature pigs respectively received the sham operation (group A,n=16),continuous negative pressure suction (group B,n=8) and intermittent negative pressure suction (group C,n=8).The pigs were observed for 3 months after 72 h treatment.The effect of NPWT on the migration behavior of ADSCs was observed at the cellular level.In order to avoid the influence of serum-free on cell viability,ADSCs were extracted and treated with continuous negative pressure suction or intermittent negative pressure suction for 8 h.The migration ability of ADSCs was detected by transwell.The proliferation ability of ADSCs was detected by MTT.The expression of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) was detected by Western blot.ResultsThe wound healing effect of continuous negative pressure suction group and intermittent negative pressure suction group was better than that of the control group,and compared with the control group,the number of migrating ADSCs cells had statistically significant difference (P<0.05,P<0.01),but cell proliferation had no statistically significant difference.The expression of HIF-1α was consistent with the migration results of ADSCs.ConclusionNPWT can promote the migration of rat ADSCs by up-regulating HIF-1α protein expression.

negative-pressure wound therapy;stem cells;migration

R649.9

A

1671-8348(2017)25-3463-03

2017-01-18

2017-06-06)

中国科学院-威高集团高技术研究发展计划(ZKYWG2013-05)

李晓明(1988-)，硕士，助理实验师，主要从事创伤修复、再生医学研究。

△通信作者，E-mail:zhangbo67184@163.com。