乙型副伤寒沙门氏菌在鲜切黄瓜中的生长行为及预测模型建立

, , , ,, ,, , ,青阔,*

(1.天津市农业质量标准与检测技术研究所,天津 300381;2.河北省农林科学院遗传生理研究所,河北石家庄 050051)

沙门氏菌属(Salmonellaspp.)是最常见的食源性致病菌之一,其危害范围大,在肉类食品和鱼、禽、奶、蛋类食品中均存在较高风险。据估计,美国每年源于沙门氏菌属细菌感染的病例约140万,且连续10年被美国CDC作为导致食源性疾病爆发的6类病原微生物监测对象之一[1-2]。我国每年由沙门氏菌引起的食物中毒事件在细菌性食物中毒事件中屡居首位[3-4]。近年来,欧美国家不断爆发即食果蔬和鲜切果蔬被沙门氏菌污染的事件,并逐年呈上升趋势[5-6]。生菜、黄瓜、番茄、菠菜、瓜类、豆芽、果蔬沙拉等都曾分离出沙门氏菌[7-8]。

由于我国食品消费和食用方式与欧美等国家相差较大,大多蔬菜均经高温处理后才食用,所以致病菌污染问题一直未受到重视[9]。但是,随着人们饮食观念的逐渐转变,果蔬沙拉、凉拌菜、生食蔬菜等逐渐受到人们的青睐。此类蔬菜一般不经过高温处理,简单清洗加工后即可食用。特别是鲜切果蔬在加工过程中由于果蔬表皮组织的破坏,造成鲜切果蔬表面汁液等营养物质的渗出,从而加大了致病菌侵染的风险[10]。鲜切果蔬的特点使其具有较高的安全风险隐患,据估计,欧洲在2002～2011年间非动物性食源性疾病的爆发则占到了90%，其中由鲜切果蔬引起的占到了第一位[11-12]。

目前,我国对即食鲜切果蔬中沙门氏菌生长预测模型的研究较少,主要是生菜、卷心菜、苹果等有少量研究报道,偶有蒜苗、香菜、西红柿、黄瓜、小葱的研究报道[13],应用微生物预测模型可以快速有效地对病原微生物的生长、存活和死亡进行拟合和预测,从而确保食品在生产、运输、贮存等风险模块中的安全性,是一种防止病原微生物对食品污染并控制其在安全食用水平的有效预警工具[14-15]。

本研究相对于前人对鲜切黄瓜中沙门氏菌的模型构建,选取农贸市场风险筛查实验中筛查到黄瓜中的乙型副伤寒沙门氏菌为研究对象,实际预警应用性更强;同时模型构建拟合温度范围选取10～35 ℃下的培养条件,温度范围更广,且包含了沙门氏菌的最适生长温度35 ℃,即风险预警最高点的温度;同时在各个温度,参照Combase等相关软件,选取了培养时间更为合理更为精准的下点测定时间,由此在每个温度下都能得到沙门氏菌在鲜切黄瓜预警中的货架期,因此将能为鲜切黄瓜中沙门氏菌的污染防控提供更为科学的技术支撑。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

黄瓜 天津市农贸市场,运回实验室后于4 ℃冰箱保藏备用;乙型副伤寒沙门氏菌CMCC(B)50094 为本室保藏标准菌株,中国工业微生物菌种保藏管理中心;营养肉汤、缓冲蛋白胨水(BPW)培养基、亚硫酸铋琼脂(BS)培养基、生化鉴定试剂盒、菌株保藏磁珠等 北京陆桥技术有限责任公司;法国科玛嘉沙门氏菌显色培养基 郑州博赛生物科技有限公司。

JYD-400型拍击式均质器 上海之信仪器有限公司;SN310C型全自动高压灭菌锅 日本三洋有限公司;DRP-9272型电热恒温培养箱 上海一恒有限公司;HL-200i型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Thermo S1电动移液器 美国热电公司;ESCO生物安全柜 新加坡艺思高有限公司;CJ-2F超净工作台 苏州市金燕净化设备有限公司;OLYMPUS CX31显微镜 德国奥林巴斯公司。

1.2实验方法

1.2.1 接种液的制备 取沙门氏菌保藏磁珠1粒,接种于100 mL灭菌营养肉汤中,36 ℃培养18 h,进行菌株活化,对活化后的新鲜菌液进行亚硫酸铋(BS)琼脂平板计数,计算菌液浓度,对其进行适宜梯度稀释,得到浓度为2×104CFU/mL的沙门氏菌菌液,4 ℃冰箱保藏备用。

1.2.2 样品处理及本底检测 新鲜黄瓜在无菌室用灭菌刀具去皮后切成1 cm3左右的小丁,将其平摊于无菌超净台内,紫外线下灭菌30 min,再关闭紫外灯于超净台内排风30 min,去除紫外残留。无菌操作分装为20 g 每份于无菌均质袋中,共分装110袋,置于4 ℃冰箱中备用。同时,随机抽取上述分装样品2份,分别加入180 mL缓冲蛋白胨水,拍击式均质器均质1 min,取0.2 mL涂布于亚硫酸铋(BS)琼脂平板表面,36 ℃培养48 h,进行黄瓜的本底检测,本底要求无沙门氏菌生长。

1.2.3 样品接种 用无菌吸管吸取1 mL浓度为2×104CFU/mL的沙门氏菌菌液接种至20 g/袋的经紫外线下灭菌的黄瓜丁,尽量使其混合均匀,使黄瓜丁的初始带菌浓度为1×103CFU/g,模拟不同温度(10、15、20、25、30、35 ℃)进行恒温培养,每隔一段时间,取出样品,放入 180 mL缓冲蛋白胨水中,拍击式均质器均质1 min,用移液器吸取0.2 mL稀释液涂布于亚硫酸铋(BS)琼脂平板,于36 ℃倒置培养48 h后,进行菌落计数。

1.2.4 应用IPMP 2013构建一级预测模型 应用USDA Integrated Predictive Modeling Program Tools(IPMP 2014)工具中Full Growth Models中的Huang Model、Baranyi Model、Gompertz Model分别对实验数据进行生长曲线的拟合,建立初级模型,获得最大比生长速率。对不同模型SSE、MSE、RMSE、AIC等相关参数进行比较,确定最适初级预测模型。Huang Model的表达式为:

式(1)

式(2)

式中:t,时间(h);Y(t),t时的菌数(ln CFU/g);Y0,初始菌数(ln CFU/g);Ymax,最大菌数(ln CFU/g);μmax,最大比生长速率(ln CFU/g/h);λ,延滞期时间(h);α,延滞期变异系数为4[16]。

1.2.5 应用IPMP 2013构建二级预测模型 应用USDA Integrated Predictive Modeling Program Tools(IPMP 2014)工具中Secondary models-Temperature effect中的Ratkowsky(3)、Huang rate(4)、Cardinal(5)、Arrhenius-type(6)这4个模型,拟合鲜切黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌最大比生长速率与温度的函数关系,建立二级模型,并通过误差平方和SSE,均方误差MSE,均方根误差/标准误差RMSE,残留标准偏差Residual stdev等模型参数进行拟合度的比较,对所建立模型进行评价。模型表达式如下:

式(3)

式(4)

μmax=μopt(T-Tmax)(T-Tmin)2/[(Topt-Tmin)(T-Topt)-(Topt-Tmax)(Topt+Tmin-2T)](Topt-Tmin)

式(5)

式(6)

式(3)中:μ,最大比生长速率(ln CFU/g/h);T,特定生长温度(℃);T0,最低生长温度;a,模型的参数;

表1 不同模型相关参数的比较Table 1 The comparison of different model parameters

式(4)中:μ,最大比生长速率(ln CFU/g/h);T,特定生长温度(℃);Tmin,最低生长温度;a,模型的参数;

式(5)中:μmax,最大比生长速率(ln CFU/g/h);T,特定生长温度(℃);Tmin和Tmax,最低生长温度和最高生长温度;μopt,最适温度Topt下的生长速率(ln CFU/g/h);

式(6)中:μmax,最大比生长速率(ln CFU/g/h);T,特定生长温度(℃);R,气体常数(8.134 J/mol);ΔG′,与细菌生长有关的一种动能;a和n,模型的参数。

1.2.6 二级预测模型的评价 对二级模型进行数学评价,分析Ratkowsky Model、Huang rate Model、Cardinal Model、Arrhenius-type Model等二级模型拟合的最大比生长速率预测值和观测值之间的拟合程度,分别用A

式(7)

式(8)

式(7)式(8)中obs是实验实际测得的微生物数量;pred是应用生长动力学模型得到的与obs同一时间的微生物数量;n是实验次数。

2 结果与分析

2.1初级预测模型的建立

根据10、15、20、25、30、35 ℃乙型副伤寒沙门氏菌在鲜切黄瓜中生长实验观察值,选用Huang Model、Baranyi Model、Gompertz Model、Buchanan Three-Phase Linear Model分别描述乙型副伤寒沙门氏菌在鲜切黄瓜中的生长动态。实验数据和生长曲线显示乙型副伤寒沙门氏菌的生长表现出三个阶段,包括延滞期、指数期和稳定期。通过不同模型SSE、MSE、RMSE、AIC等相关参数的比较,确定初级预测模型,如表1所示。

图1 Huang模型拟合的10、15、20、25、30、35 ℃条件下测定的鲜切黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌的生长数据Fig.1 The growth data of Salmonella Paratyphi B in cucumber fitted of Baranyi model at different temperatures for 10,15,20,25,30,35 ℃,respectively

SSE、MSE、RMSE、residual stdev、AIC是对方程的错误分析,参数值越小,表明方程描述乙型副伤寒沙门氏菌的生长动态误差越小。

表2 Huang模型和Baranyi模型不同温度下乙型副伤寒沙门氏菌的最大比生长速率和延滞期Table 2 The maximum growth rate and lag of Salmonella Paratyphi B at different temperatures

SSE代表误差平方和,MSE代表均方误差,RMSE代表均方根误差/标准误差,residual stdev 代表残差方差,AIC代表Akaike准则。通过误差分析(误差大小A

图2 Baranyi模型拟合的10、15、20、25、30、35 ℃条件下测定的鲜切黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌的生长数据Fig.2 The growth data of Salmonella Paratyphi B in cucumber fitted of Baranyi model at different temperatures for 10,15,20,25,30,35 ℃,respectively

在10 ℃时,乙型副伤寒沙门氏菌的生长比较缓慢,延滞期时间较长;随着温度的升高,乙型副伤寒沙门氏菌的生长逐渐加快,延滞期时间明显缩短,最大比生长速率逐渐增加,具体数值见表2。因此得出,在本研究设立的10～35 ℃的范围内,乙型副伤寒沙门氏菌的延滞期时间随着孵育时间的增加而降低;相反,乙型副伤寒沙门氏菌的生长速率随着孵育温度而增加,由此表明风险随温度的升高而增加。

2.2二级模型的建立

应用Ratkowsky、Huang rate、Cardinal、Arrhenius-type这4个模型,将表2中得到的Huang模型和Baranyi模型的最大比生长速率与温度这一环境条件进行拟合,拟合结果见图3、图4、表3。由此可知,在对最大比生长速率的拟合方面,Huang模型拟合的Ratkowsky、Huang rate、Cardinal、Arrhenius-type这4个二级模型的SSE、MSE、RMSE、Residual stdev(残留标准偏差)参数值均小于Baranyi模型拟合结果,参数值越小表明方程描述沙门氏菌的生长动态误差越小,方程的拟合度越好,通过参数值分析4个二级模型拟合度为Cardinal Model>Arrhenius-type Model>Ratkowsky Model>Huang rate Model。

表3 不同模型相关参数的比较Table 3 The comparison of different model parameters

2.3二级模型的评价

图3 Huang模型不同温度条件下乙型副伤寒沙门氏菌的最大比生长速率拟合的Ratkowsky、Huang rate、Cardinal、Arrhenius-type模型Fig.3 Huang Model under different temperature conditions of Salmonella Paratyphi B in the maximum specific growth rate fitting Ratkowsky,Huang rate,Cardinal,Arrhenius-type model

图4 Baranyi模型不同温度条件下乙型副伤寒沙门氏菌的最大比生长速率拟合的Ratkowsky、Huang rate、Cardinal、Arrhenius-type模型Fig.4 Baranyi Model under different temperature conditions of Salmonella Paratyphi B in the maximum specific growth rate fitting Ratkowsky,Huang rate,Cardinal,Arrhenius-type model

2.3.1 二级模型的数学评价 对由Huang Model拟合的二级模型进行数学评价,一级模型中Huang Model拟合的最大比生长速率观测值及其与温度构建的Ratkowsky Model、Huang rate Model、Cardinal Model、Arrhenius-type Model等二级模型拟合的最大比生长速率预测值见表4。预测值和观测值之间的拟合程度分别用A

表4 不同温度条件下沙门氏菌的观测值和预测值Table 4 Observed and predicted values of Salmonella Paratyphi B under different temperatures conditions

注:在每一行中,数值后不同的大写字母表示预测值与观测值之间存在的差异绝对值。

2.3.2 恒定温度实测验证评价 应用IPMP 2013软件由Huang Model一级模型拟合构建的Cardinal Model二级模型,进一步进行恒定温度的样品实测验证实验。应用建立的生长动力学模型求得30 ℃和35 ℃ 贮藏时的预测值,与鲜切黄瓜中30 ℃和 35 ℃贮藏实验中实际样品的沙门氏菌生长数值进行比较,见表5,采用偏差度(Bias factor,Bf,)和准确度(Accuracy factor,Af,)来评价已经建立的沙门氏菌生长动力学模型的可靠性。验证指标值Bf与Af值均处于1.03～1.12之间,均接近于1,说明该模型对鲜切黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌的生长行为具有良好的预测能力。

表5 不同温度下实测值与预测值的比较Table 5 The comparison of measured values and predicted values under different temperature

3 结论

本研究利用USDA Integrated Predictive Modeling Program(IPMP 2013)工具中的一级和二级模型,拟合不同温度(10、15、20、25、30、35 ℃)下乙型副伤寒沙门氏菌在鲜切黄瓜中的生长变化情况,分别用Huang模型和Baranyi模型进行拟合,建立了鲜切黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌生长动力学一级模型,并在此基础上,采用Ratkowsky模型、Huang rate模型、Cardinal模型、Arrhenius-type模型描述温度与比生长速率的关系,建立相应的二级动力学模型。结果表明,Huang模型更适合用于预测不同温度下鲜切黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌随时间增长的生长动态变化,实验数据和生长曲线显示乙型副伤寒沙门氏菌的生长表现出三个阶段,包括延滞期,指数期和稳定期。在10、15、20、2 5、30、35 ℃条件下,乙型副伤寒沙门氏菌的生长速率分别为0.059、0.274、0.548、0.820、1.100、1.294 ln CFU/g/h,延滞期分别为 19.741、10.944、6.634、4.976、2.171、1.448 h。乙型副伤寒沙门氏菌的延滞期时间随着孵育时间的增加而降低。相反,乙型副伤寒沙门氏菌的生长速率随着孵育温度而增加,由此表明风险随温度的升高而增加。Cardinal模型可较好描述鲜切黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌比生长速率与温度的变化关系,验证指标Af 值与Bf值均处于1.03～1.12之间,说明该模型对鲜切黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌的生长行为具有良好的预测能力。本研究构建的预测微生物学模型可为乙型副伤寒沙门氏菌行为变化的研究以及沙门氏菌定量微生物风险评估提供有效的数据基础,为控制鲜切黄瓜及其制品的生产、加工、流通、贮藏条件,以及保障鲜切黄瓜食用安全提供一定的参考依据。

[1]Laurak K,Michelle D. Fate of Escherichia coil O157∶H7 and Salmonella on fresh and frozen cut pineapples[J]. Journal of Food Protection,2010,73(3):418-424.

[2]赵新,王永,刘娜,等. 金针菇中单增李斯特菌生长预测模型的建立[J]. 生物加工过程,2016,14(6):12-17.

[3]Yang B,Qu D,Zhang X,et al. Prevalence and characterization of Salmonella serovars in retail meats of marketplace in Shaanxi,China[J]. International Journal of Food Microbiology,2010,141(1):63-72.

[4]马晨,陈雪华,李建国. 国标法与快速法检测沙门氏菌的结果比较[J]. 食品科技,2015(9):276-282.

[5]Lynch M F,Tauxe R V,Hedberg C W. The growing burden of foodborne outbreaks due to contaminated fresh produce:risks and opportunities[J]. Epidemiology and Infection,2009,137(3):307-315.

[6]Brandl M T,Cox C E,Teplitski M. Salmonella interactions with plants and their associated microbiota[J]. Phytopathology,2013,103(4):316-325.

[7]Deering A J,Mauer L J,Pruitt R E. Internalization ofE.coliO157∶H7 andSalmonellaspp. in plants:a review[J]. Food Research International,2012,45(2):567-575.

[8]马晨,李建国,程景. 沙门氏菌在鲜切蔬菜中生长行为及其预测模型构建[J]. 食品工业科技,2016(4):29.

[9]刘一倩,易欣欣. 新鲜蔬果中食源性致病细菌研究进展[J]. 生物技术通报,2014,27(4):19-24.

[10]Francis G A,Gallone A,Nychas G J,et al. Factors affecting quality and safety of fresh-cut produce[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2012,52(7):595-610.

[11]Painter J A. Attribution of Foodborne Illnesses,Hospitalizations,and Deaths to Food Commodities by using Outbreak Data,United States,1998-2008-Volume 19,Number 3-March 2013-Emerging Infectious Disease journal-CDC[J]. 2013,19(3):407-415.

[12]罗惟,陈敏,陈安均,等. 基于生长预测模型研究温度对鲜切苹果中大肠杆菌和沙门氏菌生长的影响[J]. 中国农学通报,2015,31(11):170-176.

[13]Sant’Ana A S,Barbosa M S,Destro M T,et al. Growth potential of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in nine types of ready-to-eat vegetables stored at variable temperature conditions during shelf-life[J]. International Journal of Food Microbiology,2012,157(1):52-58.

[14]Pin C,Avendao-Perez G,Cosciani-Cunico E,et al. Modelling Salmonella concentration throughout the pork supply chain by considering growth and survival in fluctuating conditions of temperature,pH and a w[J]. International Journal of Food Microbiology,2011,145:S96-S102.

[15]郑婷,董鹏程,王仁欢,等. 冷却牛肉中沙门氏菌生长预测模型的建立和验证[J]. 食品与发酵工业,2015,41(7):38-44.

[16]周康,李平兰. 不同浓度沙门氏菌细胞生长分布规律研究[J]. 食品科学,2012,33(13):254-258.

[17]姜英杰,邹晓葵,彭增起. 大肠杆菌在猪背最长肌上生长预测模型的建立[J]. 食品科学,2008,29(12):115-119.

[18]李飞燕. 冷却牛肉菌落总数生长模型及货架期预测模型的研究[D]. 济南:山东农业大学,2011.