乳铁蛋白水解物修饰物的分离纯化及其抗大肠杆菌活性

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(1.辽宁大学,辽宁大学轻型产业学院,辽宁沈阳 110000;2.乳品科学教育部重点实验室,东北农业大学,黑龙江哈尔滨 150030)

食源性抗菌肽具有抑菌活性好、安全无毒副作用的优点,是开发绿色健康新型食品防腐剂的重要候选者。乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白,其来源广,存在于许多外分泌物中,包括牛奶、眼泪、唾液等[1]。已有研究证实,乳铁蛋白经过水解抑菌活性有所提高,并将人乳来源的水解物命名为lactoferricin H,牛乳来源的水解物命名为lactoferricin B(LfcinB)[2]。经胃蛋白酶水解的乳铁蛋白,能够释放出具有生理和药理作用的生物活性肽,包括抗菌肽[3]。因此,乳铁蛋白抗菌肽在研究新型食品防腐剂、新型抗生素、防止食品腐败等方面有着巨大的应用潜力[1]。

类蛋白反应是蛋白常规酶解的逆过程,在酶的作用下高质量浓度的蛋白水解产物形成不溶于水的产物和凝胶型产物,这些产物称为类蛋白物[4]。类蛋白反应能够使多肽链和氨基酸残基发生变化,引起多肽分子组成和空间结构发生变化,进而生物活性发生改变。近年来,对类蛋白物的修饰也有了大量研究,Zhao[5]等人的研究结果表明,酪蛋白水解物的类蛋白反应修饰产物,在抗氧化活性方面有显著提高。孙玥[6]等人研究发现,乳铁蛋白水解物(LHS)利用类蛋白反应导入色氨酸和精氨酸后抑菌活性提高,且色氨酸修饰物抑菌活性高于精氨酸修饰物抑菌活性。

分离纯化技术已成为获得高活性抗菌肽的常用方法之一。J Li[7]等利用凝胶过滤色谱和高效液相色谱高效分离纯化出了一种蛙皮肤粘液中的抗菌肽。李畅[8]等利用盐析和凝胶过滤色谱对乳铁蛋白水解物进行了分离纯化,得到抑菌活性提高的抗菌肽。目前,还没有对乳铁蛋白水解物的类蛋白修饰产物进行分离纯化方面的研究。本文在前期研究的基础上,对乳铁蛋白水解物色氨酸修饰产物采用葡聚糖凝胶过滤色谱G-25进行分离纯化,测定抑菌活性后利用高压液相色谱分析纯化产物的纯度,以期为高活性高纯度抗菌肽的制备提供参考,为食品防腐剂等的研究开发提供新思路。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

乳铁蛋白(纯度97%) 新西兰Westland Milk Products公司;色氨酸甲酯盐酸盐 阿拉丁试剂股份有限公司;胃蛋白酶 中国惠世生化试剂有限公司;大肠杆菌 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室提供;牛肉膏 北京奥博星生物技术有限责任公司;水解酪蛋白 Sigma公司;可溶性淀粉 天津市东丽区天大化学试剂厂;葡聚糖凝胶(Gephadex)G-25 Summus公司;超纯娃哈哈饮用纯净水 娃哈哈集团有限公司;三氟乙酸 天津市博迪化工有限公司;乙腈(色谱纯) Dikma公司。

DELTA 320型pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Alpha 1-4中型冻干机 德国Matin Christ公司;HZQ-F160全温振荡培养箱 哈尔滨东联电子技术开发有限公司;BIO-RAD 680酶标仪 美国BIO-RAD公司;WD-9405B型水平摇床 北京市六一仪器厂;手提式灭菌锅 上海医用核子仪器厂;ZHOH-1109无菌操作台 上海毅听实验室设备有限公司;1.6×70 cm层析柱 上海华美实验仪器厂;抽滤装置 津腾科技仪器有限公司;KQ3200DE型数控超声波清洗器 杭州机电五厂;蛋白质纯化仪 General Electric Company;C18色谱柱(250 mm×10 mm;i.d.5 μm) 台湾YMC公司;RP-HPLC系统 Waters公司。

1.2实验方法

1.2.1 菌株培养 取保存于甘油中的大肠杆菌,接种于MH培养基中。37 ℃条件下振荡培养活化菌种,使菌液充分恢复活力。最后用MH培养基稀释至菌密度为105CFU/mL,用于后续的抑菌性测定实验。以上步骤均在无菌操作台上进行。

MH培养基制备方法为:牛肉膏2.00 g,水解酪蛋白17.50 g,可溶性淀粉1.50 g,溶于1.00 L水中,调节pH至7.40,溶解后高压灭菌锅中灭菌(121 ℃,15 min)备用。

1.2.2 乳铁蛋白水解物及其色氨酸修饰物的制备 乳铁蛋白的水解条件为:乳铁蛋白底物浓度5%(w/v),pH(2.50±0.10),胃蛋白酶活力与乳铁蛋白浓度比(E/S)是1.00 kU/g,37 ℃水浴条件下水解时间为4 h。反应结束后80 ℃灭酶15 min,pH调至(5.00±0.10)。再4 ℃冷冻离心(17000×g)15 min,收集上清,冷冻干燥保存备用[7]。

Trp修饰产物的制备条件为:LHs浓度为40%(w/w),pH调至5.00,色氨酸游离氨基含量与总游离氨基比为0.70 mol/mol,胃蛋白酶活力与LHS浓度比为2.00 kU/g,反应温度37 ℃,反应时间12 h。反应结束后80 ℃灭酶15 min,储存于-20 ℃并冷冻干燥保存备用[6]。

1.2.3 葡聚糖凝胶Sephadex G-25过滤色谱分离纯化 配制样品LHS及其Trp修饰物浓度为20 mg/mL,0.45 μm滤膜过滤除菌。超纯水作为洗脱液,使用前超声脱气30 min,超声功率为360 W,备用。将Sephadex G-25凝胶过滤色谱柱与蛋白纯化仪联用,流速0.50 mL/min。平衡色谱柱至基线水平[8]。平衡柱子结束后上样,上样量1.00 mL,上样浓度20 mg/mL,洗脱速度0.50 mL/min,同时以280 nm波长的紫外检测仪检测,记录洗脱图谱,收集各洗脱峰。将各收集峰的洗脱液于-20 ℃预冻并冷冻干燥。各洗脱组分用微量稀释法分别测定其抑菌性,大量收集抑菌活性最好的出峰产物用于后续实验。

1.2.4 蛋白酶活力测定 采用福林法,参考SB/T 10317-1999[9]。

1.2.5 蛋白质含量的测定 采用凯氏定氮法,参考GB/T 5009.5-2016[10]。

1.2.6 游离氨基含量的测定 采用邻苯二甲醛(OPA)法,测定游离氨基含量[11]。

1.2.7 蛋白水解度的计算 蛋白质水解度(DH)是指每克水解的蛋白中裂解的肽键毫摩尔数与水解前蛋白中全部肽键毫摩尔数的百分比。蛋白水解度的计算式如下:

式中:X1-蛋白水解后游离氨基含量(mmol/g);X2-蛋白水解前游离氨基含量(mmol/g);8.658-乳铁蛋白中的肽键含量(mmol/g)。

1.2.8 微量稀释法测定抑菌性 配制适宜浓度的抑菌物质,并用0.22 μm的醋酸纤维素膜过滤除菌。在96孔板中对抑菌物质进行梯度稀释,得到不同浓度的抑菌物质孔,保证每孔抑菌物质添加量为50 μL。再加入50 μL稀释好的菌液,于37 ℃培养箱中孵育24 h。酶标仪测定其在630 nm处的吸光值记为OD0;将抑菌物质替换为无菌生理盐水,相同条件下孵育,测定630 nm处的吸光值为OD1;加入50 μL的无菌生理盐水和50 μL的MH培养基溶液孔,相同条件下孵育,测定630 nm处的吸光值为OD2[13]。每组实验设5个平行孔,重复3次。抑菌率计算公式如下:

式中:OD0-添加抑菌物质的大肠杆菌生长体系吸光值;OD1-未添加抑菌物质的大肠杆菌生长体系吸光值;OD2-培养基和无菌生理盐水的吸光值。

1.2.9 反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定 分析将凝胶过滤色谱分离得到的活性较好的出峰产物配制成浓度为3 mg/mL,0.45 μm滤膜过滤除菌。A液0.1% TFA和B液色谱级乙腈作为流动相进行梯度洗脱,使用前真空抽滤去除杂质灰尘,超声脱气30 min,备用。RP-HPLC分析的流动相洗脱分为以下四个梯度:0～15 min时,A液90%,B液10%;15～20 min时,A液75%,B液25%;20～29 min时,B液100%;29～60 min时,A液90%,B液10%。上样体积15 μL,上样浓度3.00 mg/mL,检测流速为0.50 mL/min,同时以280 nm波长的紫外检测仪检测,记录检测图谱[13]。

1.3数据处理

采用Origin 8.0和Word 2010软件作图,实验数据均为多次重复实验结果的平均值,结果以平均值±标准偏差表示。采用SPSS17.0软件中的单因素方差分析及Duncan多重比较分析进行数据统计,p<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1葡聚糖凝胶过滤色谱G-25分离纯化

采用葡聚糖凝胶过滤色谱G-25对LHS进行分离纯化,分离纯化图谱结果,如图1。可以看出,LHS经过分离纯化得到两种出峰产物,峰1和峰2。洗脱体积约为34 mL,洗脱时间约78 min时出现峰1,洗脱体积约为75 mL,洗脱时间约150 min时,出现峰2。峰1显著高于峰2,分别收集峰1和峰2组分,于-20 ℃预冻并冷冻干燥处理测定其抑菌性。

图1 LHS水解物的葡聚糖凝胶过滤色谱图Fig.1 Sephadex gel filtration chromatogram of lactoferrin hydrolysate

采用葡聚糖凝胶过滤色谱G-25对Trp修饰产物进行分离纯化,分离纯化图谱结果,如图2。可以看出,Trp修饰产物经过分离纯化得到三种出峰产物峰1、峰2和峰3。洗脱体积约为45 mL,洗脱时间约为90 min时出现峰1组分,峰1显著高于峰2和峰3。分别收集峰1、峰2和峰3组分,于-20 ℃预冻并冷冻干燥处理测定其抑菌性。

图2 Trp修饰产物的葡聚糖凝胶过滤色谱图Fig.2 Sephadex gel filtration chromatogram of tryptophan modifier

这五种出峰产物的抑菌活性比较结果,如表1。可以看出,LHS纯化峰1产物的抑菌活性为41.42%,其对应的峰2产物无抑菌活性。Trp修饰物纯化峰1产物的抑菌活性较其对应的峰2、峰3产物抑菌活性也有显著提高(p<0.05)。Trp修饰物纯化峰2产物与其峰3产物抑菌活性无显著性差异(p>0.05)。可见两者抑菌活性最高的纯化峰均为峰1,收集抑菌活性最高的纯化峰1产物进行后续实验。

表1 不同出峰产物的蛋白质含量及抑菌活性Table 1 Antibacterial activity and protein content of peak products

注:-表示未检测出抑菌活性,表中不同上标字母代表显著性差异(p<0.05)。

2.2各级产物蛋白含量及抑菌活性比较

乳铁蛋白经胃蛋白酶水解生成多肽,利用游离氨基的减少量可以判断类蛋白反应的发生。采用OPA法得出游离氨基的减少量为45.00 μmol/g,乳铁蛋白水解物的水解度为6.18%。采用福林法,测定胃蛋白酶活力为16.9 kU/g。采用凯氏定氮法测定LHS、LHS纯化峰1产物、Trp修饰物、Trp纯化峰1产物的蛋白质含量分别为82.01%、96.98%、78.13%和98.63%。LHS纯化峰1产物和Trp纯化峰1产物的蛋白质含量显著高于其对应未纯化产物(p<0.05)。

表2 两种浓度下产物抑菌率Table 2 The antibacterial rates of products at two concentrations

注:-表示未检测出抑菌活性,表中同一列数据不同上标字母代表显著性差异(p<0.05)。

由于纯化产物上样量较低收集量相对较少,前期实验结果表明LHS的最小抑菌浓度为200 mg/mL,LHS纯化峰1产物的最小抑菌浓度为100 mg/mL。因此纯化产物只测定在100 mg/mL浓度下的抑菌活性,非蛋白纯化产物测定其在100 mg/mL和200 mg/mL两种浓度下的抑菌活性。比较100 mg/mL和200 mg/mL两种浓度下各级产物的抑菌活性,结果见表2。

可以看出,浓度100 mg/mL时,LHS无抑菌活性,Trp纯化峰1产物抑菌活性显著高于Trp修饰产物,Trp修饰产物抑菌活性显著高于LHS纯化峰1产物(p<0.05)。峰1产物纯化后抗大肠杆菌活性高可能是由于纯化后所得峰1的蛋白质含量高,所含抗菌肽纯度高导致。各级产物的抑菌效果为LHS纯化峰1产物

2.3反相高效液相色谱分析

收集活性较高的LHS-1和Trp-1进行进一步的HPLC分析。采用A液0.10% TFA和B液色谱级乙腈作为流动相进行梯度洗脱,得到LHS-1的色谱图检测结果,如图3。Trp-1的色谱图检测结果,如图4。可以看出,LHS纯化峰1产物经过C18色谱柱后得到多个吸收峰,出峰时间在21～41 min之间,该物质有待于进一步分离纯化。Trp修饰物纯化峰1产物经过C18色谱柱后得到单一峰,出峰时间在19 min处,可见该产物的纯度相对较高。两种物质出峰时间不同,进一步验证了类蛋白修饰反应的发生。

图3 LHS-1的RP-HPLC分离色谱图Fig.3 RP-HPLC chromatogram of LHS-1 separation

图4 Trp-1的RP-HPLC分离色谱图Fig.4 RP-HPLC chromatogram of Trp-1 separation

3 结论

本研究利用凝胶过滤色谱对乳铁蛋白水解物的类蛋白色氨酸修饰物分离纯化,得到了纯度相对较高且抗大肠杆菌活性提高的新型抗菌肽。通过对LHS和其Trp修饰产物进行蛋白纯化仪分离纯化,收集各出峰组分进行抗大肠杆菌活性测定,得到峰1为最高抑菌活性峰。对峰1出峰产物进一步利用RP-HPLC分析,LHS-1的RP-HPLC检测得到多个吸收峰,有待于进一步分离。Trp-1的RP-HPLC检测得到单一峰,说明所得抗大肠杆菌肽的纯度相对较高。两种物质出峰时间不同,进一步验证了类蛋白修饰反应的发生。色氨酸修饰物对大肠杆菌的抑菌率较未修饰前提高了45.41%,色氨酸修饰产物经过纯化后对大肠杆菌的抑菌率较未纯化前提高了29.69%。本研究通过对类蛋白修饰物的分离纯化得到了纯度相对较高、抑菌活性提高的抗菌肽,为一种抗大肠杆菌肽的制备提供了新思路,为食品防腐剂的研发提供了新原料。

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