响应面法优化龙胆草多糖的脱色工艺

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(贵州师范大学化学与材料科学学院,贵州贵阳 550001)

龙胆草是龙胆科植物三花龙胆(GentianatrifloraPall.)、坚龙胆(GentianariescensFranch)、条叶龙胆(GentianamaushurieaKitag)或龙胆(GentianaseabraBye)干燥的根和根茎[1]。在我国主要分布于东北三省、内蒙古、湖南、湖北、浙江、云南、贵州、广西和四川等地,国外主要产于朝鲜和日本[2]。龙胆草具有清热燥湿、清肝泻胆的功效[2]。多糖为龙胆中一种有效成分[3],龙胆多糖具有许多生理活性,如具有降血脂[4]、抗凝血[5]、抗氧化[6]、抗肿瘤[1]、保肝利胆、免疫调节[7-9]等作用。

在提取龙胆多糖的过程中,色素也很容易被提取出来,所以龙胆粗多糖的颜色较深。一方面色素的存在会影响多糖的活性,另一方面由于后续工作通常要利用离子交换层析和凝胶柱层析对龙胆多糖进行分离纯化[10-11],在上柱前通常需要去除粗多糖中的色素,否则色素会增大多糖分离纯化的技术难度[12]。目前对龙胆多糖脱色的文献较少,相关的报道只有H2O2脱色法、AB-8大孔吸附树脂静态脱色法、活性炭法[11]。研究发现聚酰胺能对一些多糖溶液进行脱色,比如对骏枣多糖[13]、绿茶多糖[14]、桦褐孔菌多糖[15]、金针菇多糖[16]、猕猴桃根多糖[17]、竹叶多糖[18]、阿魏菇多糖[19]等植物多糖均有较好的脱色效果。一般来说,植物色素为羟基蒽醌衍生物、酚类等小分子物质,这些物质可以和聚酰胺通过氢键缔合,这种缔合能力比聚酰胺与多糖的结合能力强,所以在水溶液中首先被吸附[20]。而且由于聚酰胺不但可以吸附色素,还可以最大限度地保持多糖的活性,价格便宜,是一种高效率、低成本的方法[18]。目前还没有利用聚酰胺对龙胆多糖进行脱色的相关报道,因此本文以黔产龙胆草为原料提取多糖,在单因素实验的基础上,采用响应面法优化聚酰胺柱层析脱色法,得到最佳脱色工艺,并对聚酰胺树脂的重复利用性进行研究,旨在为龙胆草多糖的初步纯化提供理论数据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

龙胆草 购于贵州济仁堂,产地为贵州;聚酰胺树脂(30～60目) 郑州勤实科技有限公司;其它试剂均为国产分析纯。

101-1A 型干燥箱 天津泰斯特公司;A200S型电子天平 德国科恩公司;SHB-IIIA型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸公司;U V 2300型分光光度计 上海天美科学仪器公司;FZ 102 型植物粉碎机 天津市泰斯特公司。

1.2实验方法

1.2.1 龙胆草多糖的提取 提取方法参考文献[21]并做修改。将龙胆草用去离子水洗净、烘干并粉碎,过40目筛,乙醚回流脱脂,挥干乙醚并干燥。在80 ℃热水中浸提2 h(料液比1∶30),减压过滤后取清液,将清液浓缩至原体积的1/5,加入3倍体积的无水乙醇,冰箱中静置24 h,抽滤,依次用丙酮、无水乙醇洗涤沉淀,自然风干,得到龙胆草粗多糖,并按照下式计算多糖得率。

多糖得率(%)=(粗多糖质量/药材质量)×100

1.2.2 聚酰胺的预处理 聚酰胺处理方法参考文献并略作修改[22],向聚酰胺树脂中加入浓度为95%的乙醇,所加乙醇的体积为树脂体积的3倍,浸泡24 h,然后用蒸馏水洗涤至聚酰胺无乙醇味,再加入4%的NaOH浸泡2 h,用蒸馏水洗涤至中性,再用4%的HCl浸泡2 h,用蒸馏水洗涤至中性,用蒸馏水浸泡以备用。

1.2.3 单因素实验 在预实验的基础上选取龙胆草多糖的上样体积、上样浓度、上样流速三个因素对聚酰胺脱色的影响进行研究。

1.2.3.1 上样体积对聚酰胺脱色的影响 取30 mL处理好的聚酰胺湿法装入9根规格相同的层析柱中,分别以1、2、3、4、5、6、7、8、9 BV的上样体积进样,固定上样浓度为6 mg/mL,上样流速为2 BV/h。在450 nm与490 nm处测吸光度,测定龙胆多糖溶液的脱色率和多糖保留率,以及综合评分OD值。

1.2.3.2 上样流速对聚酰胺树脂脱色的影响 取30 mL处理好的聚酰胺湿法装入5根规格相同的层析柱中分别以0.5、1、2、3、4 BV/h的流速上样,固定上样浓度为6 mg/mL,上样体积为5 BV。在450 nm与490 nm处测吸光度,并计算龙胆多糖的脱色率和多糖保留率,以及综合评分OD值。

1.2.3.3 上样浓度对聚酰胺脱色的影响 取30 mL处理好的聚酰胺湿法装入5根规格相同的层析柱中,分别以2、3、4、5、6 mg/mL的浓度上样,固定上样体积为5 BV,上样流速为2 BV/h。在450 nm与490 nm处测吸光度,并计算龙胆多糖的脱色率和多糖保留率,以及综合评分OD值。

1.2.4 响应面实验设计 在单因素实验的基础上,按照Box-Behnken的中心组合设计原理,选取上样体积(X1)、上样流速(X2)、上样浓度(X3)为响应因素,以龙胆草多糖脱色率(Y1)和多糖保留率(Y2)综合得出的综合评分(OD)为响应值。设计三因素三水平的Box-Behnken实验,通过Design-Expert设计软件,对龙胆草多糖树脂脱色工艺进行优化。因素水平表见表1。

表1 响应面分析法的因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.2.5 聚酰胺的再生及其再生后脱色能力考察 将聚酰胺按优化条件得到的最佳脱色条件进行脱色,将使用过的聚酰胺进行再生处理,处理方法同“1.2.2”中的聚酰胺预处理方法一样。树脂反复使用5次,每一次均测定多糖脱色后的脱色率和多糖保留率,以此考察聚酰胺的再生能力。

1.2.6 指标的测定

1.2.6.1 多糖保留率的测定方法 参考文献[23]采用硫酸-苯酚法绘制葡萄糖标准曲线,曲线为y=0.0502x+0.0235,R2=0.9997,线性范围在0～10 μg/mL。并测定龙胆多糖脱色前后的多糖含量,计算出多糖保留率。

多糖保留率(%)=(脱色后多糖质量/脱色前多糖质量)×100

1.2.6.2 多糖脱色率的测定方法 将龙胆草多糖样品溶液适当稀释,在200～800 nm范围内进行全波长扫描,以确定该色素的最大吸收波长,扫描结果显示龙胆草多糖样液在可见光区无最大吸收,根据光的互补色原理,溶液本身所呈的颜色即为它吸收光的互补色,由于龙胆草多糖溶液为橙黄色,所以判断溶液主要吸收蓝色波段的可见光。因此本实验选择蓝色波段中心波长为检测波长,即测定450 nm处该溶液的吸光度A[24],并计算出脱色率。

1.2.6.3 OD值的计算 以龙胆草多糖脱色率(Y1)和多糖保留率(Y2)为指标,两个指标的权重系数均为0.5,按照综合评判公式计算出归一值OD=MY1+NY2,其中M、N分别为龙胆多糖脱色率(Y1)和多糖保留率(Y2)的权重系数,且M和N值均为0.5[25-26]。

1.2.7 数据处理 实验所有数据为三次重复实验的平均值,结果以平均值±标准偏差表示;采用Origin9.0作图;采用DesignExpert8.0.6.1软件中的Box-Behnken Design(BBD)响应面优化分析。

2 结果与讨论

2.1单因素实验结果

2.1.1 上样体积对脱色效果的影响 在一定的上样浓度和上样流速条件下,以不同的龙胆草多糖溶液上样体积(1、2、3、4、5、6、7、8、9 BV)进行脱色实验,结果如图1和图2所示。从图1中可知,脱色率随着上样体积的增加而逐渐减少,当上样体积为1 BV时,脱色率为98.04%±0.31%,当上样体积为9 BV时,脱色率为58.98%±0.41%。这可能是由于上样体积达到了一定程度,树脂已经达到了最大的处理量,所以上样体积再增大,脱色效率会降低[27];而随着上样体积的增大,多糖保留率随之增大,但在上样体积大于5 BV时,增大的趋势有所减少。当上样体积为1 BV时,多糖保留率较低,仅为11.97%±0.34%,而上样体积为9 BV时,多糖保留率可达78.26%±0.56%。所以上样体积太小或太大都不合适。从图2可以看出,综合评分OD值随着上样体积的增加呈先增大后减小的趋势。当上样体积为5 BV时,综合评分OD值最大,综合考虑脱色率、多糖保留率和综合评分OD值,选择5 BV为龙胆多糖脱色较适宜的上样体积。

图1 上样体积对脱色效果的影响Fig.1 Effect of sample volume on the decolorization effect rate

图2 上样体积对OD值的影响Fig.2 Effect of sample volume on the OD value

2.1.2 上样流速对聚酰胺树脂脱色的影响 在上样体积和上样浓度一定的条件下,以不同的上样流速(0.5、1、2、3、4 BV/h)进行脱色实验,结果如图3和图4所示。随着流速的增加,脱色率呈迅速下降的趋势,这可能是流速加快了,使龙胆多糖色素与树脂的接触时间缩短,而使树脂对色素的吸附能力降低了[28];而随着流速的增加,多糖保留率则呈上升趋势,这可能是由于流速快能缩短上柱液在树脂柱中的扩散,使多糖样液能迅速流出树脂柱,从而使多糖保留率提高[29]。当上样流速为0.5 BV/h时,脱色率为83.22%±0.39%,多糖保留率为75.00%±0.29%,当上样流速为4 BV/h时,脱色率为75.58%±0.15%,多糖保留率为87.76%±0.20%。从图4可以看出,综合评分OD值随着上样流速的增加呈先较快增加,再缓慢下降的趋势,当上样流速为2 BV/h时,综合评分OD值为最大。综合考虑脱色率、多糖保留率和综合评分OD值,选择2 BV/h为龙胆多糖脱色的较适宜的上样流速。

图3 上样流速对脱色效果的影响Fig.3 Effect of flow rate on the decolorization effect rate

图4 上样流速对OD值的影响Fig.4 Effect of flow rate on the OD value

图5 上样浓度对脱色效果的影响Fig.5 Effect of sample concentration on the decolorization rate

2.1.3 上样浓度对聚酰胺树脂脱色的影响 在上样流速和上样体积固定的条件下,以不同浓度的龙胆多糖溶液(2、3、4、5、6 mg/mL)进行脱色实验,结果见图5和图6所示。随着上样浓度的增大,脱色率呈降低的趋势,当浓度大于4 mg/mL时,脱色率下降的趋势加快;随着上样浓度的增高,多糖保留率呈升高的趋势。当上样浓度为2 mg/mL时,脱色率为84.30%±0.16%,多糖保留率为68.43%±0.26%,而当上样浓度为6 mg/mL时,脱色率为70.40%±0.16%,多糖保留率为90.70%±0.11%。这可能是树脂对多糖和色素的吸附能力有一定的极限,上样浓度太大则会超过树脂的最大处理量,从而导致随着上样浓度的增加,脱色率减小而多糖保留率增加。从图6可以看出,综合评分OD随着上样浓度的增加呈现先增加,再缓慢减小的趋势,当上样浓度为4 mg/mL时,综合评分OD值为最大。因此综合考虑脱色率、多糖保留率和综合评分OD值,选择4 mg/mL为龙胆多糖的较适宜的上样浓度。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

图6 上样浓度对OD值的影响Fig.6 Effect of sample concentration on the OD value

注:*表示影响显著(p<0.05);**表示影响极显著(p<0.01)。

2.2响应面实验结果与数据分析

2.2.1 Box-Behnken实验结果 根据表1中的因素水平值,利用Design-Expert8.0.6软件设计出实验方案,方案中共有17个实验点,其中有5组是零点,12组是析因点。实验方案和结果见表2。

表2 响应面法的实验设计及结果Table 2 Expertmental design and results of response surface analysis

对所得实验数据进行多元拟合分析,建立二次响应面回归方程,本实验以龙胆草多糖脱色率和多糖保留率算出的归一值(OD)为响应值,由此得到龙胆草多糖脱色率和上样体积、上样浓度和上样流速的二次多项回归模型为:

OD=0.87-9.850×10-3X1-0.01X2-0.030X3-4.750×10-4X1X2+9.075×10-3X1X3-0.025X2X3-0.062(X1)2-0.053(X2)2-0.042(X3)2

该回归模型中的一次项X3、二次项X12、X22和X32对OD值的影响极显著。说明上样浓度对龙胆草多糖脱色工艺影响极显著,上样流速和上样体积对龙胆草多糖脱色工艺的影响不显著。各因素对龙胆草多糖脱色工艺的影响大小顺序为:上样浓度(X3)>上样流速(X2)>上样体积(X1)。

图7 各因素交互作用的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots showing the effect of various hydrolysis conditions

2.2.2 响应面图的分析 响应面法可以通过固定次数的实验对实验因素进行分析,得到较直观的3D图形,从而可以评价各因素之间的交互作用,响应面图弯曲度越大,表明两因素间越显著[24]。此外,等高线的形状也可以反映因素之间交互作用的强弱,如椭圆形表示两因素交互作用显著,圆形则表示交互作用不显著[30]。通过对响应面的陡峭程度分析,上样浓度对OD值的影响最大,其次是上样流速和上样体积;通过对等高线的分析发现,上样浓度和上样流速的等高线为椭圆形,说明这两个因素交互作用显著。而上样体积和上样流速的等高线与上样体积和上样浓度的等高线为圆形,所以说明上样体积和上样流速交互作用不显著,上样体积和上样浓度交互作用不显著。这与方差分析结果一致。

2.2.3 响应面分析和最优脱色条件的确定 回归模型中的OD最大估计值为0.8794,与之对应的自变量上样体积(X1)为4.89 BV,上样流速(X2)为1.99 BV/h,上样浓度(X3)为3.63 mg/mL。为了检验该条件的可靠性,需要进行验证实验,考虑到实际操作的可行性,将工艺条件改为上样体积为5 BV,上样流速为2 BV/h,上样浓度为3.50 mg/mL,测得龙胆草多糖的脱色率(Y1)为80.60%±0.91%,多糖保留率(Y2)为86.28%±0.67%,算出其OD值为0.8344。理论预测值和实测值相比,误差较小,相对误差为-5.12%,说明本实验建立的二次多项回归模型可以很好地预测因素和响应值之间的变化关系。

2.3聚酰胺再生后的脱色效果

随着聚酰胺使用次数的增加,上面会残留许多杂质,使柱体颜色加深且柱效降低,所以要对其处理再生。由图8可以看出,再生聚酰胺脱色效果随着使用次数的增加而缓慢降低,而多糖保留率随着使用次数的增加而略有增加,重复使用5次后,脱色率为76.85%±0.59%,多糖保留率为98.32%±0.37%。这有可能是由于聚酰胺使用后会产生一些死体积而造成对色素和多糖的吸附能力降低,而使脱色率下降,多糖保留率升高。聚酰胺在使用5次以后,脱色效果降低的幅度较小,该树脂对龙胆多糖的脱色具有良好的实用价值,再生效果较好。

图8 再生聚酰胺对脱色效果的影响Fig.8 Effect on decolorization rate of polyamide regeneration

3 结论

在单因素实验的基础上,通过Box-Behnken实验设计方法对龙胆脱色进行3因素3水平设计,以综合评分OD值为响应值,并用Design Expert 8.0.6对数据进行处理。实验结果得到采用聚酰胺对龙胆多糖的最佳脱色工艺为:上样体积为5 BV,上样流速为2 BV/h,上样浓度为3.50 mg/mL。在此条件下进行验证实验,测得多糖保留率为86.28%±0.67%,脱色率为80.60%±0.91%,与理论值接近,表明模型可靠。

再生聚酰胺的脱色实验表明,聚酰胺在使用5次以后,脱色率下降为76.85%±0.59%,而多糖保留率明显升高,升高到98.32%±0.37%。说明聚酰胺多次使用后脱色效果还是比较明显,适于回收利用,减低成本。此法简单可行,可为龙胆多糖的初步纯化提供依据。

本实验仅研究了聚酰胺对龙胆粗多糖的脱色效果和工艺,没有研究聚酰胺对龙胆粗多糖中其他杂质的吸附效果。此外,利用聚酰胺对龙胆粗多糖脱色后是否会影响其生物活性也尚未可知,所以今后还应该对这方面进行深入研究。

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