薰衣草残渣中黄酮的超声辅助提取工艺及其抗氧化活性

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(1.南京林业大学轻工与食品学院,江苏南京 210037；2.重庆第二师范学院食品安全与营养研究所，重庆 400067；3.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 737100；4.重庆第二师范学院生物与化学工程学院,重庆 400067)

薰衣草(LavandulaangustifoliaMill.)是一种名贵而重要的天然香料植物,在新疆伊犁种植面积达3万多亩(1亩=666.7平方米)。薰衣草花穗提制的精油芳香宜人,具有杀菌、松弛平滑肌、镇静、催眠等作用,因此广泛用于日用化妆品工业中[1]。我国每年的薰衣草精油年产量已超过10万公斤,薰衣草精油仅占薰衣草干花含量的1.5%左右[2],因此工业上提取薰衣草花精油后剩余的残渣中仍含有大量的其它成分,有研究表明残渣中主要含有大量蛋白质、糖类、黄酮、微量元素等物质,若直接扔弃将造成极大的资源浪费[3-4]。

黄酮类化合物是一种存在于植物中的天然产物,属于天然抗氧化剂,药理学研究表明从植物茎叶、花卉中通过溶剂萃取、超临界流体萃取、微波提取等方法提取黄酮,如荞麦壳、银杏叶、蜜柚叶等,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等多种生物活性[5-8]。薰衣草残渣中因化学组成复杂难于有效提取黄酮,本实验利用超声波的空化效应、热效应以及机械效应等作用,将薰衣草组织细胞中的黄酮有效释放后提取,该方法简便有效、设备的维护和保养方便,若能将残渣中的黄酮进行有效利用,既可以解决薰衣草精油生产过程中的废渣处理问题,又可使其得到充分利用,这对于挖掘薰衣草的潜在价值,扩大薰衣草产业无疑是一个重要途径。目前鲜见对薰衣草残渣的深入研究与开发,本研究对薰衣草残渣中黄酮类物质的提取条件进行优化,并通过总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、铁离子螯合能力和总还原能力四个方面考察黄酮纯化物的抗氧化能力,为开发综合利用薰衣草资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

DPPH、ABTS+、Ferrozine溶液 国药集团化学试剂有限公司,上海；薰衣草残渣(固体)水蒸气蒸馏薰衣草干花提取精油后的剩余物,真空冷冻干燥后备用 由新疆农业科学院提供。

XO-2B型超声波提取器 南京先欧仪器制造有限公司;800B型离心机 上海安亭科学仪器厂制造;HL-2B型恒流泵 上海沪西分析仪器厂有限公司;电脑全自动部分收集器 上海琪特分析仪器有限公司;BUCHI R-210型旋转蒸发仪 南京贺而顿仪器公司;DK-S26型电热恒温水浴锅 上海右一仪器公司制造;UVmini-1240型紫外分光光度计 北京艾飞博科技有限公司制造;LABCONCO型冷冻干燥机 无锡凯派克斯科技有限公司;V700型真空泵 南京贺而顿仪器公司。

1.2实验方法

1.2.1 薰衣草残渣超声辅助提取 薰衣草残渣→粉碎→乙醇溶剂超声波提取→黄酮粗提液→聚酰胺树脂柱层析法纯化→黄酮纯化物。

将干燥后的薰衣草残渣进行粉碎,过60目筛,按照一定料液比加入乙醇进行超声波提取,将提取液离心3000 r/min,上清液即为黄酮粗提液。黄酮粗提液的纯化采用聚酰胺树脂柱层析法进行,将黄酮粗提液通过旋转蒸发除去乙醇,然后采用真空冷冻干燥,得到粉末,备用。将该粉末以一定体积1∶5 (w/v)溶于蒸馏水中,采用聚酰胺树脂吸附柱(15 mm× 50 cm)纯化以除去多糖类、蛋白质等大分子物质。吸附及洗脱条件为:上样流速为0.5 mL/min,按水、乙醇水溶液20%(v/v)、70%(v/v)的顺序洗脱,洗脱流速为1 mL/min。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 乙醇浓度的影响 固定料液比为1∶10 (w/v),超声波功率为100 W,温度为45 ℃,提取时间为55 min,以50%、60%、70%、80%、90% 浓度的乙醇作为溶剂,考察不同体积分数的乙醇对黄酮提取率的影响。

1.2.2.2 提取时间的影响 固定料液比为1∶10 (w/v),超声波功率为100 W,温度为45 ℃,以体积分数为70%的乙醇溶液为提取溶剂,分别将提取时间设定为50、60、70、80、90、100、110 min,考察不同提取时间对黄酮提取率的影响。

1.2.2.3 料液比的影响 固定超声波功率为100 W,提取温度为45 ℃,提取时间为90 min,以体积分数为70%的乙醇溶液,设置料液比分别为1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11,考察不同提取料液比对黄酮提取率的影响。

1.2.2.4 提取温度的影响 固定提取时间90 min,料液比1∶10,超声波功率100 W,乙醇体积分数70%,提取温度分别为:30、35、40、45、50、55、60 ℃,考察不同温度对黄酮提取率的影响。

1.2.2.5 超声功率的影响 固定提取时间90 min,提取温度45 ℃,料液比1∶10 (w/v),乙醇体积分数70%,分别设置超声波功率为50、60、70、80、90、110 W,考察不同超声波功率对黄酮提取率的影响。

1.2.3 响应面实验 参照李珍等[9]根据响应面 Box-Behnken,在单因素实验的基础上,选取乙醇浓度X1、提取时间X2、料液比X3、提取温度X4共4个因素对黄酮提取影响显著的因子,以黄酮提取率为响应值,采用4因子3水平的响应面分析法,得到二次回归方程,并找出最佳工艺参数。实验设计如表1所示。

表1 响应面设计实验因子与水平Table 1 The experimental factors and level of RSM test

1.2.4 黄酮含量的测定 准确称取芦丁标准对照品200 mg,用70%乙醇溶解,定容至100 mL容量瓶中摇匀。移取10 mL于25 mL容量瓶中,用蒸馏水定容,得到0.8 mg/mL标准溶液。准确吸取标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分别置于10 mL容量瓶中,加入5%亚硝酸钠0.4 mL,放置6 min后,再加入10%硝酸铝0.4 mL,放置6 min后,再加入4%氢氧化钠4 mL,加蒸馏水至刻度线,摇匀,放置15 min后,进行全波长扫描,在510 nm处有最大吸收波长。在此波长下测定,得出芦丁浓度与吸光度的标准曲线(Y=10.364X+0.0016,R2=1.0000)。准确吸取粗提液1.0 mL,置于25 mL容量瓶中定容,再从中吸取1 mL于10 mL容量瓶中,加5%亚硝酸钠0.4 mL,按与标准曲线相同的方法测定吸光值,以标准曲线计算黄酮质量。黄酮提取率为黄酮质量与薰衣草残渣质量之比的百分率。

1.2.5 黄酮纯化物的总抗氧化能力 参照Annapandian等[10]的方法略作改动。将5 mL 7 mmol/L ABTS+和88 μL 140 mmol/L过硫酸钾混合,配制ABTS+自由基储备液,避光保存备用。取0.1 mL不同浓度待测液,加入3.9 mL ABTS+工作液,振荡30 s,室温下静置6 min后,以无水乙醇为对照,在734 nm处测吸光值变化,采用VC作参照。按式(1)计算ABTS+自由基清除率:

式(1)

式(1)中:Ai为加入待测液的吸光值;Aj为待测液的本底值;A0为不加待测液的对照值。

1.2.6 清除DPPH·能力 参照Xie等[11]的方法略有改动。用无水乙醇配制浓度为0.2 mmol/L DPPH·溶液,现用现配。取2 mL不同浓度的待测液,最后加入2 mL DPPH·溶液,在室温避光静置30 min,以无水乙醇为对照,在517 nm处测吸光值变化,采用VC作参照。按式(2)计算DPPH·清除率:

式(2)

式(2)中:Ai为加入待测液的吸光值;Aj为待测液的本底值;A0为不加待测液的对照值。

1.2.7 还原力 参照Wu等[12]的方法略有改动。 取0.5 mL待测液加入pH6.6的PBS缓冲液2.0 mL和1%铁氰化钾溶液2.5 mL,混合后在50 ℃下水浴加热20 min,加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL,3000 r/min离心10 min,取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液,混匀,静置10 min,在700 nm处测定吸光度,以PBS溶液作对照,采用VC作参照。还原力按式(3)计算:

还原力A700=A-A0

式(3)

式(3)中:A为加入样品的吸光值,A0为不加样品的对照组吸光值。

1.2.8 铁离子螯合能力 参照 Boonsong[13]的方法略有改动。具体操作方法为取待测样品1 mL,加入1 mmol/L的FeCl2·4H2O溶液0.1 mL,混合均匀静置15 min加入0.5 mmol/L Ferrozine溶液0.2 mL,加蒸馏水补足至5 mL充分振荡均匀,室温静置20 min,以蒸馏水为参比于 562 nm测定吸光度,对照以等体积蒸馏水取代样品,其余操作完全相同,采用VC作参照。螯合能力按式(4)计算:

式(4)

式(4)中:A:样品的吸光度;A0:为不加样品的对照组吸光值。

1.2.9 数据统计分析 所有实验重复3次,最终结果为测定的数据取平均值,应用Excel2007、SPSS13.0软件进行数据统计处理。

2 结果与讨论

2.1单因素实验结果与分析

从薰衣草残渣中提取黄酮受乙醇浓度、时间、料液比、温度及超声波功率等因素的影响,结果如图1所示。

由图1A可知,残渣在乙醇体积分数为50%～70%范围内,随着体积分数的增加,薰衣草残渣提取液吸光度显著上升,超过70%后提取液吸光度呈下降趋势,说明在乙醇体积分数为 70%时薰衣草残渣黄酮得率最大,因此确定乙醇体积分数为70%,这可能因为薰衣草残渣中黄酮的极性与乙醇溶液相似,黄酮类物质易于从残渣组织中释放。

由图1B可知随超声波提取时间的增加提取率呈现先升高后下降的趋势,即开始随时间延长吸光度逐渐升高,提取率增大,在90 min时吸光度达到最大值,但时间过长会造成乙醇蒸发过快,黄酮结构遭到破坏,导致得率下降,因此,最佳提取时间选取90 min。

由图1C可知,在一定范围内,随着溶剂体积的增加,溶质与溶剂接触的表面积增大,黄酮提取率逐渐增大,但是当料液比超过1∶10 (w/v)后,吸光度没有显著的变化,此时黄酮物质已基本完全从组织释放至溶剂中,再增加溶剂和物料的比例会造成乙醇的浪费,因此确定料液比为1∶10为宜。

由图1D可知,残渣中黄酮提取率随提取温度的增加呈现先升高后下降的趋势,在45 ℃时提取率达到最大值,因此确定提取温度在45 ℃。随着温度的升高,提取率增大,但过高的温度会造成乙醇蒸发过快,黄酮的结构遭到破坏,导致得率下降。

由图1E可知,在60～100 W的功率范围内,残渣中黄酮纯化物吸光度与功率成正比,在100 W时达到最大值,超过100 W后提取得率呈下降趋势。功率过低,超声波的能量低,分子运动慢,影响黄酮物质的提取。过高的功率会产生高温,从而导致黄酮物质被破坏,降低了黄酮提取得率,因此确定提取的超声波功率为100 W。

图1 提取条件对薰衣草残渣中黄酮提取率的影响Fig.1 The effect of extraction condition on flavonoids extraction efficacy注：A:乙醇浓度,B:提取时间,C:料液比,D:提取温度,E:超声波功率。

由此可见,采用单因素提取时间、温度、乙醇浓度、料液比等因素对黄酮提取率的影响,确定超声波辅助提取法的工艺条件为:料液比1∶10 (w/v),温度45 ℃,时间90 min,浓度70%,功率100 W。固定功率100 W，将其余因素进行响应面优化。

2.2响应面实验结果与分析

2.2.1 响应面回归模型的建立与分析 在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken 中心组合进行四因素三水平的实验设计。实验设计及结果如表2,以黄酮提取率Y 为响应值,进行响应面分析实验。

表2 响应面实验设计与结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

应用Design Expert进行回归拟合分析,可得到提取条件与黄酮提取率之间的二次多项式模型为:Y=3.01+0.12X1+0.088X2-0.039X3+0.052X4-0.062X1X2+0.11X1X3-0.12X1X4-0.064X2X3-0.094X2X4+0.087X3X4-0.26X12-0.14X22-0.083X32-0.047X42。

由表3回归方程各项方差分析表明,回归模型p值=0.0037,具有高度的显著性(p<0.01),此模型拟合良好,可靠性强。因素X1、X2、X12、X22对薰衣草残渣中黄酮提取率有显著的影响,X3、X4、X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4、X32、X42对薰衣草残渣中黄酮提取率没有显著的影响。各因子对薰衣草残渣黄酮提取率的影响大小依次是X1>X2>X4>X3。

表3 回归的方差分析Table 3 Analysis of variance in regression

图2 因素间相互作用对提取率的影响Fig.2 The effect of interaction between factors on flavonoids extraction efficacy

2.2.2 两因子间交互作用分析 回归分析结果的响应面图及其等高线图中曲面坡度的陡峭和等高线形状可反映交互作用的强弱趋势[14-18],如图2所示。图2a为提取时间和乙醇浓度对黄酮提取率的交互作用。响应面图开口向下,存在极大值点,交互作用显著。当乙醇浓度一定时,黄酮提取率受提取时间影响大,坡度陡。当提取时间一定时,黄酮提取率受乙醇浓度影响显著。

图2b为料液比和乙醇浓度对黄酮提取率的交互作用。由图可知,当乙醇浓度一定时,黄酮提取率受料液比影响较大,坡度较陡。当料液比一定时,黄酮提取率受乙醇浓度呈现先增大后减小的趋势,特别是在较高区域曲面坡度陡,影响显著。

图2c为提取温度和乙醇浓度对黄酮提取率的交互作用,乙醇浓度一定时,黄酮提取率随提取温度呈增加趋势。当提取温度一定时,黄酮提取率随乙醇浓度的增大,呈现先增大后减小的趋势,整体曲面坡度平缓,显著性较弱。

图3 黄酮纯化物的抗氧化能力Fig.3 Antioxidant activity of flavonoids extracts

从图2d提取时间和料液比对黄酮提取率的交互作用可知,当料液比一定时,随着提取时间的延长,黄酮取率先平缓上升再呈平缓下降趋势。提取时间一定时,随料液比的增大,黄酮提取率先增大后减小,曲面整体坡度较平缓,显著性差。

图2e为提取时间和提取温度对黄酮提取率的交互作用。可见,当提取温度一定时,随着提取时间的延长,黄酮提取率先增大后趋于平稳。当提取时间一定时,随着提取温度的增大,黄酮提取率先增大再平缓的减小,曲面整体坡度较平缓,显著性较差。

图2f为提取温度和料液比对黄酮提取率的交互作用,当提取温度一定时,随着料液比的变化,黄酮提取率缓慢下降。当料液比一定时,随提取温度的增大,黄酮提取率整体坡度较为平缓,呈现出较弱的显著性。

该模型的最优工艺条件为:提取时间92 min、乙醇浓度74%、提取温度48 ℃、料液比1∶10 (w/v),预测值为3.1132 mg/g。在此条件下实际测定的黄酮提取率可达到(3.1125±0.2010) mg/g,与预测值3.1132 mg/g误差小,可见该模型能准确用于薰衣草残渣中黄酮的提取,可靠性强。

2.3薰衣草残渣中黄酮纯化物的抗氧化能力

从图3A可以看出,黄酮纯化物的总抗氧化能力随着黄酮浓度的增大而增大,当浓度在0.5～1.5 mg/mL之间时,总抗氧化能力随着浓度的增大显著增大,当浓度大于1.5 mg/mL后开始趋于平缓,在测定浓度范围内,总抗氧化能力达到80%以上,说明其抗氧化能力较强。由图3B可知,黄酮纯化物清除DPPH自由基的能力随着黄酮浓度的增大而上升。当浓度达到6 mg/mL时清除率为81.11%。黄酮类化合物对铁离子具有很强的还原能力[19-22],它们提供的电子能够将 Fe3+还原为Fe2+。由图3C所示,抗氧化能力的大小和溶液的吸光度值呈正相关,吸光度值越高,样品的还原能力越强,抗氧化性越高。

金属铁是许多自由基产生过程的催化剂。Fe2+可介导脂质过氧化,同时还是·OH等产生的媒介物。FeCl2与Ferrozine溶液混合在562 nm有吸收峰,当加入铁离子螯合剂时,其吸光度会下降[19-23],根据吸光度的变化可以判断样品螯合铁离子的能力。铁离子螯合率与抗氧化能力呈正相关,螯合率越高,则抗氧化能力越强。如图3D所示,随着黄酮浓度的增大,螯合率显著增大。综合4个方面的评价结果可见,薰衣草残渣中的黄酮具有较强抗氧化能力。

3 结论

本文以薰衣草残渣为研究对象,采用单因素和响应面法对薰衣草残渣中黄酮的超声辅助提取工艺进行优化,最佳工艺条件为提取时间92 min、乙醇浓度74%、提取温度48 ℃、料液比1∶10 (w/v)。在此优化条件下实际测定的黄酮提取率可达到(3.1125±0.2010) mg/g,与预测值3.1132 mg/g误差小,可见该模型能准确用于薰衣草残渣中黄酮的提取,可靠性强。同时从总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、还原力和铁离子螯合能力这4个方面考察了黄酮纯化物的抗氧化能力,结果显示出黄酮纯化物具有较强的抗氧化能力,可将薰衣草残渣中的黄酮进行综合开发利用,应用于食品配料工业、化妆品业。这不仅提升了薰衣草残渣的附加值,同时还有助于减少资源浪费,减轻环境压力。

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