不同甲酯化方法对裂壶藻产油脂肪酸的影响及GC-MS分析

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(1.武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北武汉 430023;2.嘉必优生物工程(武汉)有限公司,湖北武汉 430073;3.湖北天基生物能源科技发展有限公司,湖北汉川 432300；4.中国科学院 武汉病毒研究所,湖北武汉 430071)

裂壶藻(Schizochytrium,又称裂殖壶菌)是一类海洋真菌,裂壶藻藻油于2010年被卫生部指定为新资源食品,其富含ω-3系高度不饱和脂肪酸,主要包括二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等[1-2]。DPA和DHA都是人体所必需的脂肪酸,但在人体内难以合成,主要来自于海洋鱼类和微藻,其中裂壶藻依靠连续二分裂法生殖,分裂速度快、发酵周期短,是商业化生产DHA藻油理想的菌种之一[3-5]。

藻油的主要脂肪酸为长链多不饱和脂肪酸,其酸极性很强,是热敏性物质,在高温下不稳定,易发生聚合、脱酸、裂解等副反应,沸点高,分析中易造成损失[6-7],通常先衍生为甲酯后再检测分析。所以需要找到一种最适宜的甲酯化方法,以降低多不饱和脂肪酸的沸点并且减少其检测过程中的流失[9-10]。脂肪酸的甲酯化方法有很多,包括酸处理法、碱处理法、三氟化硼(BF3)法、简易碱式甲酯化方法、重氮甲烷法、四甲基氢氧化铵法等[11-12]方法。本文通过对裂壶藻进行培养发酵、收集藻体、酶法破壁、冷冻干燥等工艺得到干菌体,然后通过索氏抽提对干菌体提取油脂。采用了酸法、碱法和三氟化硼法三种甲酯化方法分别对提取的藻油进行甲酯化处理,用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术分析,分别鉴定出脂肪酸组成,并对其主要成分进行对比[13-15]。通过比较裂壶藻藻油的脂肪酸组成差异,从而确定最适合的甲酯化方法,对微生物油脂的脂肪酸检测有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

裂壶藻株 ATCC20888 购于广东微生物菌种保藏中心,并经过等离子诱变获得的裂壶藻突变株15 k-160 s-2-3,本实验室保存；正己烷、无水甲醇、无水乙醚、无水乙醇、甲醇、硫酸、氢氧化钠、14%三氟化硼甲醇、无水硫酸钠 天津市科密欧化学试剂有限公司;纤维素酶(10-140万U/g)、碱性蛋白酶(20万U/g) 江苏锐阳生物科技有限公司;所用试剂均为分析纯。

LDZX-75KB立式蒸汽灭菌器 武汉利天科技仪器有限公司;SW-CJ-1F单人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司;HYQ-150S恒温摇床 武汉汇诚生物科技有限公司;TDL-5-A 台式离心机 上海安亭科学仪器厂;RE-52C 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;索氏提取器 上海洪纪仪器设备有限公司;SY21-K 型电热恒温水浴锅 北京长风仪器仪表公司;FD-8 冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;GC 7890A-MS 5975C 气相色谱-质谱联用仪 安捷伦科技(中国)有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 裂壶藻培养基 种子培养基:葡萄糖8.5%、谷氨酸钠6.5%、酵母膏0.6%、氯化钠2.0%、磷酸二氢钾0.65%、硫酸镁2.2%、氯化钙0.03%、碳酸氢钠0.03%、硫酸钠0.03%、金属离子混合液(CoCl2,0.0065 g/L;MnCl2,0.1623 g/L;ZnCl2,0.0122 g/L;H3BO3,0.1020 g/L;FeCl3,0.0556 g/L;EDTA,0.15 g/L;CuSO4,0.0492 g/L)、维生素混合液(硫胺素,0.9973 g/L;生物素,0.110 g/L;钴胺素,0.103 g/L);120 ℃、20 min。发酵培养基:葡萄糖7.5%、谷氨酸钠1.5%、酵母膏1.1%、氯化钠0.2%、磷酸二氢钾0.5%、硫酸镁0.6%、氯化钙0.06%、碳酸氢钠0.06%、氯化钾0.04%、金属离子混合液(CoCl2,0.0065 g/L;MnCl2,0.1623 g/L;ZnCl2,0.0122 g/L;H3BO3,0.1020 g/L;FeCl3,0.0556 g/L;EDTA,0.15 g/L;CuSO4,0.0492 g/L)、维生素混合液(硫胺素,0.9973 g/L;生物素,0.110 g/L;钴胺素,0.103 g/L);120 ℃、20 min。

1.2.2 裂壶藻的培养 用接种环从固体培养基挑取藻种接入种子培养基中,置于摇床上,26 ℃、180 r/min条件下培养48 h。用灭过菌的吸管吸取10%的种子液,转接于发酵培养基中,于26 ℃、180 r/min的条件下,振荡培养2 d后将温度降为22 ℃继续发酵培养5 d[16]后提取油脂。

1.2.3 藻油的制备 发酵结束后,收集裂壶藻发酵液在5000 r/min的条件下离心10 min,去除上清液,重复此操作两次。将离心得到的藻泥与水按料液比1∶1 (g/mL)混合均匀,置于恒温磁力搅拌器中,温度60 ℃下搅拌,按发酵液体积的0.5%和0.025%分别加入碱性蛋白酶和纤维素酶,55 ℃酶解6～8 h,置于真空冷冻干燥机中干燥至质量恒定,然后研磨成藻粉,装入滤纸筒,放入索氏抽提器中,用乙醚注入索氏抽提,用略高于提取剂沸点的温度,恒温水浴抽提直至藻粉无色,旋转蒸发残留溶剂后得到藻油,收集备用。

1.2.4 脂肪酸甲酯化处理

1.2.4.1 酸法 称取2.00 g的藻油于500 mL烧杯中;称取5.00 g氢氧化钠加至50 mL无水乙醇中,待其溶解后加至有样品的烧杯中。烧杯置于70～75 ℃的水浴中皂化1 h。按1∶1体积比加入99%浓硫酸进行酸化。上层脂肪酸用蒸馏水洗至中性。取0.10 g脂肪酸于5 mL容量瓶中,加2～3 mL无水甲醇于水浴上加热溶解。滴加浓硫酸6～8滴,充分摇匀。放置15 min后加入3～4 mL蒸馏水和1 mL正己烷,剧烈振摇2 min,静置分层,取有机相待测[17-18]。

1.2.4.2 碱法 称取0.2 g的藻油于20 mL试管中,加入0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液2 mL,置于电热恒温水浴锅,60 ℃条件下水浴加热至油珠完全溶解(约30 min),冷却后加入25%的BF3-CH3OH溶液2 mL,继续水浴酯化3 min。冷却后加入2 mL正己烷并振荡,再加入2 mL饱和NaCl溶液并振荡。静置30 min后取上层有机相于一只干燥试管中,并加入少量无水硫酸钠以去除微量水分,待测[19]。

1.2.4.3 三氟化硼法 称取0.2 g的藻油,加入2 mL正己烷充分振荡溶解后,加入1%硫酸-甲醇溶液2 mL混匀,置于65 ℃水浴加热60 min,冷却后加入25%的BF3-CH3OH溶液2 mL,65 ℃水浴酯化3 min,冷却后加入饱和氯化钠溶液至10 mL,振荡离心取上清,待测[20]。

1.2.5 甲酯化温度实验 为了进一步优化甲酯化的条件,实验选取影响藻油甲酯化的最敏感的因素温度来进行实验探索,分别选取甲酯化温度50、55、60、65、70 ℃进行甲酯化并用GC-MS进行检测分析,重复三次实验。

1.2.6 色谱条件 色谱柱:HP-FFAP石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);升温程序:140 ℃保持1 min,以5 ℃/min升温至190 ℃,保持0 min,再以2 ℃/min升温至220 ℃,保持10 min;进样口温度:250 ℃;载气流量:1.0 mL/min;进样量:1 μL;分流比:50∶1;溶剂延时:4.0 min。

1.2.7 质谱条件 电子轰击(EI)离子源;电离能量70 eV;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;接口温度250 ℃;全扫描模式,质量扫描范围m/z 50～500。

1.2.8 分析鉴定 利用GC-MS分析,通过化学工作站G1701BA的数据处理系统,利用Nist11标准质谱库检索鉴定成分,按面积归一化法进行定量分析,测得其相对百分含量。

2 结果与分析

2.1脂肪酸分析

按照实验步骤进行实验,结果由化学工作站给出，藻油的总离子流图(TIC)分别示于图1A(酸法)、图1B(碱法)、图1C(三氟化硼法),及DHA甲酯的质谱图2。

图1 DHA藻油脂肪酸甲酯总离子流图Fig.1 TIC profile of fatty acids methyl ester in DHA algae oil注:A.酸法;B.碱法;C三氟化硼法。

图2 DHA(C22∶6)甲酯的质谱图Fig.2 Mass specutrum of DHA(22∶6)methyl ester

将三种甲酯化方法处理的DHA藻油经GC-MS分析检测,各脂肪酸的组成及占总油的相对百分含量列于表1。

表1 DHA藻油脂肪酸的鉴定结果Table 1 Summary of identification of fatty acids in DHA algae oil

注:-表示未检出。

由表1可知,采用酸法可鉴定出11种脂肪酸,占总DHA藻油的89.50%。其中棕榈酸占藻油总量的15.15%,二十二碳五烯酸酸(DPA)占藻油总量的16.91%,二十二碳六烯酸(DHA)占藻油总量的38.89%。采用碱法可鉴定出19种脂肪酸,占总的DHA藻油的97.88%。其中棕榈酸占藻油总量的13.91%,DPA占藻油总量的20.54%,DHA占藻油总量的46.76%。采用三氟化硼法可鉴定出12种脂肪酸,占总的DHA藻油的90.12%。其中棕榈酸占藻油总量的16.94%,DPA占藻油总量的15.94%,DHA占藻油总量的40.54%。所确定的化学成分的质谱图由联用仪的计算机谱图库检索,所检测出的脂肪酸的可信度大部分均在90%以上。

根据藻油的检测结果可以看出,碱法鉴定出的脂肪酸成分多于酸法及三氟化硼法,且鉴定的脂肪酸占藻油总量的比例均有差异,尤其是长链多不饱和脂肪酸DHA和DPA有着较大的差异,原因可能是酸法步骤较多,并且在皂化酸化过程中温度过高,使脂肪酸发生了变性,被转化为其他非酸类物质,通过化学工作站对酸法的总离子流图的分析,也发现有较多的醇醛类化合物离子峰。而碱法及三氟化硼法本质的区别在于碱法用的是碱处理法,而三氟化硼法则用的是酸处理法,由实验结果可以得知,藻油富含多不饱和脂肪酸,用碱处理法则更加适用,能检测出较多脂肪酸成分,并且在甲酯化过程中对DHA等长链多不饱和脂肪酸的保护作用较强,不易造成流失,因而选择碱法为藻油的最优甲酯化方法。再对其甲酯化温度进一步实验得到最佳的酯化温度,从而对藻油更科学精准的检测有着较完整的探究。

2.2甲酯化温度的优选

对于碱法的实验过程中,影响甲酯化效果的因素有很多,甲酯化过程中的水浴温度对结果有很大的影响。实验选取温度来进行探索,分别考察甲酯化温度50、55、60、65、70 ℃进行甲酯化并用GC-MS进行检测分析,重复三次实验后用DHA、DPA的相对含量作为衡量指标得出的结果如图3所示。

图3 甲酯化温度对DHA、DPA的相对含量的影响Fig.3 The influence of esterification temperature on the relative content of DHA and DPA

由图3可以看出,在甲酯化温度为55 ℃时DHA的含量达到了47.45%,DHA及DPA的相对含量达到最高,当温度高于55 ℃以上时,DHA及DPA的相对含量开始逐渐降低。这一结果表明藻油在甲酯化过程中对温度的要求较高,甲酯化温度对藻油中DHA和DPA的含量有很大的影响。所以,为了避免温度对脂肪酸检测结果的影响,应当选择适宜的温度(55 ℃)对藻油进行甲酯化处理。

3 结论

裂壶藻是产DHA油脂的优良菌株之一,然而长链多不饱和脂肪酸酸极性很强,在检测过程中有一定的难度,因而需要找到一种最适宜的甲酯化方法。本文采用三种不同的甲酯化方法鉴定同一批的裂壶藻藻油,并利用GC-MS进行分析检测,得到良好的实验结果。综合对比分析了三种甲酯化方法的优劣,最终选择碱法为藻油的最优检测方法,该方法检测效率高,操作简便快捷,长链不饱和脂肪酸DHA、DPA在甲酯化过程中保存较完整,流失少。实验进一步优化了甲酯化方法,选取温度来进行实验探索,最终得到碱法的最佳甲酯化温度为55 ℃。这一研究为微生物藻油的检测奠定良好的基础。

随着人们对多不饱和脂肪酸日益增长的需求,除了要从高产菌株的选育、发酵工艺的优化、设备的选型配套等方面做出研究外,对藻油的检测及标准也不容忽视。本文探索了藻油检测过程中三种不同的甲酯化方法,并采用气相色谱-质谱联用仪对藻油脂肪酸进行了分析检测,实验结果对发酵过程的调控及多不饱和脂肪酸的检测有着一定的借鉴意义。

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