程序性细胞死亡因子4与氨基末端脑利钠肽前体在冠心病猝死者体内的表达及意义

刘笃秋 陈刚 吴旭庭 王镇波 庾宇军

[摘要]目的 研究冠心病猝死患者心肌组织中程序性细胞死亡因子4（PDCD4）的表达量与心血中氨基末端脑利钠肽前体（NTproBNP）的表达变化，探讨其在冠心病猝死者体内的表达及意义。方法 选取2015年7月～2018年6月于南方医科大学第五附属医院死亡并接受尸检的死亡病例60例，根据尸检结果分为冠心病猝死组（20例）、冠脉狭窄组（20例）以及冠脉正常组（20例），每个病例均收集心肌组织一块用于测定PDCD4的mRNA表达量及蛋白表达量，并抽取右心血样本采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测血浆NTproBNP的水平。结果 冠心病猝死组心肌组织中PDCD4的mRNA表达量、蛋白表达量均高于另外两组，差异有统计学意义（P<0.05）；冠心病猝死组、冠脉狭窄组的血浆 NTproBNP含量均高于冠脉正常组，差异有统计学意义（P<0.05）；冠心病猝死组的血浆NTproBNP含量高于冠脉狭窄组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 PDCD4、NTproBNP的高表达与冠心病猝死的发生有关，能辅助判定冠心病的严重程度以及协助鉴定冠心病猝死。

[关键词]冠心病；心源性猝死；程序性细胞死亡因子 4；氨基末端脑利钠肽前体

[中图分类号] R541.4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）12（c）-0004-05

[Abstract] Objective To analyse the expression of programmed cell death 4 （PDCD4） in myocardial tissues and Amimo-Terminal Pro-Brain Natriuretic Peptide （NTproBNP） in plasma of sudden death patients with coronary heart disease and to discuss its significance. Methods Totally 60 sudden death cases that underwent autopsy in the Fifth Affiliated Hospital of Southern Medical University from July 2015 to June 2018 were collected， and divided into sudden cardiac death with coronary heart disease group （20 cases）， single coronary stenosis group （20 cases） and normal control group （20 cases） according to the autopsy results. The myocardial tissue was collected to determine the mRNA expression of PDCD4 as well as the protein expression of PDCD4. NTproBNP in plasma were detected by ELISA. Results The mRNA expression and protein expression of PDCD4 in myocardial tissue of cardiac sudden death with coronary heart disease group were significantly higher than those in the other two groups， the differences were statistically significant （P<0.05）. NTproBNP in the sudden cardiac death with coronary heart disease group and single coronary stenosis group was higher than that normal control group， the difference was statistically significant （P<0.05）. NTproBNP in the sudden cardiac death with coronary heart disease group was higher than that in the single coronary stenosis group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion These indicate that PDCD4 and NTproBNP have a certain guiding role in sudden cardiac death with coronary heart disease. PDCD4 and NTproBNP can help to identify the severity of coronary heart disease and whether it is sudden death due to coronary heart disease.

[Key words] Coronary heart disease； Sudden cardiac death； Programmed cell death 4； Amimo-Terminal Pro-Brain Natriuretic Peptide

冠状动脉粥样硬化性心脏病是由于冠状动脉发生了动脉粥样硬化病变，继而引起冠状动脉管腔狭窄或阻塞性改变，造成心肌缺血、缺氧，甚至坏死而导致的心脏疾病，简称冠心病。严重的冠心病能导致患者出现心肌梗死、恶性心律失常以及心力衰竭等，甚至会危及患者生命。冠心病分为五大類型，冠心病猝死是其中的一种分型，由于冠心病猝死的突然性以及不可预测性，给临床诊疗工作中产生极大困扰。程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是一种肿瘤抑制因子，而近年来有研究显示其不仅对细胞的程序性死亡起着重要的调节作用，而且与心血管细胞生物学也存在着非常密切的关系，并在动脉粥样硬化病变进展的过程中也起着重要的作用[1]。氨基末端脑利钠肽前体（Amimo-Terminal Pro-Brain Natriuretic Peptide，NTproBNP）作为脑利钠肽前体的裂解产物之一，其血浆分布量与心功能不全、冠状动脉粥样硬化病变等多种心脏疾病有关，对心肌缺血、缺氧以及心脏缺血再灌注等病理生理改变极为敏感，与冠脉狭窄、心肌梗死的程度呈正相关[2]，可用于临床上判断冠心病患者的预后以及预计相关死亡率[3]。本研究通过分析冠心病猝死患者心肌组织中PDCD4的表达量以及心血中NTproBNP的表达变化，探讨其对冠心病心肌损伤的临床诊疗意义，旨在为冠心病猝死的诊断和鉴定提供依据，对预防冠心病猝死寻找相应辅助预测检验指标提供新的思路及方法，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2015年7月～2018年6月于南方医科大学第五附属医院死亡并接受尸检的病例资料60例，根据尸检结果及法医鉴定分为冠心病猝死组（20例，年龄28～72岁）、冠脉狭窄组（20例，年龄27～76岁）以及冠脉正常组（20例，年龄26～78岁）。纳入标准：①冠心病猝死组均为冠状动脉或其分支狭窄程度≥Ⅲ级，因冠心病急性发作1 d内死亡；②冠脉狭窄组选取冠状动脉或其分支狭窄程度≥Ⅲ级，死亡原因为非冠心病导致的案例；③正常冠脉组选取冠脉无明显狭窄病变的死亡病例。排除标准：①冠脉正常组冠心病、心力功能不全等心源性疾病；②过敏性疾病；③治疗吗啡过量以及毒品中毒等药物干扰因素。三组的一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表 1），具有可比性。本研究已通过南方医科大学第五附属医院医学伦理委员会的批准，均已征得研究对象家属的书面同意。

1.2标本收集

实验标本包括尸检所提取的心肌组织与右心血。所有的入选案例均需在患者死后6 h内将尸体冷冻保存，并且在3 d内进行尸检。冠心病猝死组患者行尸检时提取200 mg缺血损伤部位的心肌组织，同时取右心血10 ml；冠脉狭窄组患者行尸检时提取200 mg狭窄冠脉支配血流范围内心肌组织，同时取右心血10 ml；冠脉正常组患者尸检时提取200 mg与冠心病猝死组患者提取标本相对应部位的心肌组织，同时取右心血10 ml。所有采集的心肌组织标本在液氮中快速冷冻后取出，置于-80℃超低温冰箱内保存待测。所有采集的右心血标本均经离心机分离，取血浆分装入EP管并放置于-80℃冰箱保存待检。在冻存前需要确保所有收集的血浆未发生明显溶血。

1.3观察指标及检测方法

观察指标：①心肌组织中PDCD4的mRNA表达量及蛋白表达量；②血浆中NTpro BNP的含量。

从每个病例所采集的心肌组织标本中精确分离50 mg，并使用TRIzon法提取这50 mg心肌组织中的总RNA。进一步使用相应反转录试剂盒进行核糖核酸（RNA）反转录，获取互补脱氧核糖核酸（cDNA）模板。使用PDCD4的特异性引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，根据相应基因的PCR曲线，由软件自动计算出信息核糖核酸（mRNA）相对表达量。

同样提取心肌组织标本100 mg，以预冷生理盐水充分洗涤，液氮充分预冷后研磨成粉。采用RIPA裂解液分离组织内的蛋白质，进一步孵育、离心，取上清液，得到心肌总蛋白。采用试剂盒对蛋白裂解液内PDCD4的蛋白表达量进行酶联免疫吸附（ELISA）法测定。

提取右心血分离的血浆标本，加入抗体工作液后置于恒温振荡器上孵育。洗涤液充分洗涤后加入酶标抗体工作液，进一步孵育后加入底物工作液。继续避光孵育15 min，加入终止液。最后置于酶标仪测量，并由软件自动换算输出血浆NTpro BNP浓度。

1.4统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

冠心病猝死组心肌组织中PDCD4的mRNA表达量及蛋白表达量均高于冠脉狭窄组和冠脉正常组，差异有统计学意义（P<0.05）；冠脉狭窄组心肌组织中PDCD4的mRNA表达量及蛋白表达量与冠脉正常组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；冠心病猝死组、冠脉狭窄组的血浆NTproBNP含量均高于冠脉正常组，差异有统计学意义（P<0.05）；冠心病猝死组的血浆NTproBNP含量高于冠脉狭窄组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

3讨论

冠状动脉粥样硬化性心脏病是由于冠状动脉发生动脉粥样硬化病变，进而出现冠状动脉管腔狭窄或阻塞性改变，造成心肌不同程度的缺血、缺氧，甚至坏死而导致的心脏疾病，简称冠心病[4-5]。严重的冠心病能导致患者出现心肌梗死、恶性心律失常以及心力衰竭等，甚至会危及患者生命。《2013 中国心血管病报告》[6]中统计的数据显示，心血管疾病从1990年起，就一直是我国居民的主要死亡原因。直至2012年，在我国的城市地区以及农村地区，心血管病都已成为当地居民的首要死亡原因，在全部死亡原因中的占比达到了40%。该报告预计到2020年，我国居民因心血管疾病导致的死亡人数将至少增加50%。因动脉粥样硬化性疾病死亡的人数在心血管病致死总数中占据相当大的一部分，其中冠心病及其相关的并发症，在全世界致死率的主要发生因素中也占据着极大比重[7]。

冠心病猝死是冠心病的五大类型之一，是指冠状动脉因狭窄或者痉挛病变导致的心肌供血不足、心肌功能障碍，甚至心脏器质性病变而引起的猝死[8-9]。由于冠心病猝死的突然性以及不可预测性[7]，给临床诊疗工作中产生极大困扰。一些特异性蛋白标志物虽然已在临床上用于辅助诊断急性冠脉综合征，包括肌红蛋白、肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶等[10-13]。但由于这类标志物在血液中产生和到达峰值的时间不同，同时半衰期的长短存在差别，故在冠心病猝死的诊断中受到极大限制[14]。

如今在我国各级医疗单位的医疗条件不断改善、医疗水平均持续上升的大背景下。冠心病的死亡率，包括其中的急性心肌梗死的死亡率，以及冠心病猝死的發生率仍未明显下降，即使国内现广泛开展成立针对急性冠脉综合征等高危胸痛疾病的胸痛中心[15]，而其死亡率依旧在继续上升。所以冠心病猝死相关的机制研究也一直是心血管领域研究的热门。

PDCD4是近年新发现的一种肿瘤抑制因子，但与心血管细胞生物学也存在着非常密切的关系。PDCD4基因的表达受到多种不同因素的调节[16]，包括TNF-α等多种炎性细胞因子可以调节其基因的表达。无论血管平滑肌细胞、心肌细胞在抑制增殖抑或促进程序性死亡的过程中，PDCD4均起着重要的调节作用[17]。已有研究结果显示，PDCD4基因的低表达与维持内皮细胞相应内皮功能的稳定存在着极为密切的联系，同时，血管内皮功能的正常与否和动脉粥样硬化病变的发生也密切相关[18]。提示PDCD4在动脉粥样硬化病变进展的过程中也起着重要的作用[19]。由于近年来对冠心病发病机制研究的关注，PDCD4也逐渐成为动脉粥样硬化方面研究的热点。

脑利钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）主要由心室肌细胞分泌，其主要作用如下。①舒张全身小血管的平滑肌；②抑制交感神经系统的兴奋性；③降低心脏的后负荷。对于冠脉疾病来说，BNP具有极好的预测及评估能力，故已被推荐应用于急性冠脉综合征的风险评估[20]。NTproBNP作为脑利钠肽前体的裂解产物之一，其血浆分布量与心功能不全、冠状动脉粥样硬化病变等多种心脏疾病有关，对心肌缺血、缺氧以及心脏缺血再灌注等病理生理改变极为敏感。相关研究显示在冠心病猝死患者心肌组织中BNP表达量较过敏性猝死患者和颅脑损伤死亡患者心肌组织中BNP表达量显著升高[21]，提示BNP可以辅助诊断冠心病猝死。

NTpro BNP是与BNP同时生成的一种无活性的多肽产物，两者密切相关[22]，也应具有诊断冠心病猝死的可能性。且因BNP容易降解，在体外试管中较难保存[23]。于法医学鉴定过程中，尸体往往会受到死亡时间、死亡现场以及保存条件等大量不确定性因素的影响，心肌组织会发生不同程度的腐败，其中的BNP也会有着不同程度的降解。所以BNP的精确度常因干扰因素影响出现偏差，这样会影响数据的统计学分析，故而限制了BNP的使用范围。而NTproBNP比BNP的半衰期更长，且更加稳定，不易受保存条件影响，在冠心病猝死的鉴定工作前景更佳。

本研究通过检测冠心病猝死组患者心肌组织中PDCD4的mRNA表达量及蛋白表达量，结果显示其显著高于冠脉狭窄组和冠脉正常组，而冠脉狭窄组心肌组织中PDCD4的mRNA表达量及蛋白表达量与冠脉正常组相比无显著性差异。进一步提示PDCD4的高表达与冠心病心源性猝死存在相关性，可为冠心病猝死的诊断和鉴定提供依据。同时，通过对冠心病猝死患者右心血分离血浆中NTproBNP含量的检测，结果显示其较冠脉狭窄组和冠脉正常组均显著增高，并且冠心病猝死组较冠脉狭窄组血浆NTproBNP仍显著升高，提示了NTpro BNP可能反映心肌缺血严重程度，并可作为辅助诊断冠心病猝死的参考指标，提示对PDCD4以及NTpro BNP的进一步研究，于冠心病猝死的诊断及鉴别鉴别有着极重要的意义。因此PDCD4、NTpro BNP有望应用于实际临床及法医工作中，能够根据其表达量的差异来辅助诊断冠心病猝死，同时应用于区分冠心病猝死者、伴有冠脉狭窄而非心源性因素致死者。但其中具体机制仍有待深入研究。

综上所述，PDCD4与NTproBNP可能是冠心病心肌损伤中的关键标志物，对冠心病心肌损伤的临床诊疗以及冠心病猝死的法医鉴定上具有一定的指导作用。但本次研究仍然具有一定局限性：关于不同心血管病和心源性猝死相应NTproBNP表达的具体差异，仍需要进一步的研究；研究样本量相对较少，尚需更大量的样本量使研究结果更确切。上述问题有待在以后的研究中继续完善和进一步探讨。

[参考文献]

[1]Su Q，Li L，Wang J，et al.Mechanism of programmed cell death factor4/nuclear factor-kappa B signaling pathway in porcine coronary micro-embolization-induced cardiac dysfunction[J].Exp Biol Med （Maywood），2015，240（11）：1426-1433.

[2]耿家峰.N端脑钠肽前体、脂蛋白（a）与冠心病患者冠状动脉病变的相关性[J].实用临床医药杂志，2016，20（15）：14-16.

[3]Jeong HA，Shin J，Kim E，et al.Correlation of B-type natriuretic peptide levels and echocardiographic parameters in preterm infants with patent ductus arteriosus[J].J Neurol Sci，2016，59（4）：183-189.

[4]胡鵬云，杨玉勤.稳心颗粒对冠心病合并心律失常患者QT间期离散度的影响[J].实用心电学杂志，2018，27（2）：119-120，124.

[5]刘力，赵文姣.尼沙赫精准心电图与心电图同步分析冠心病改变的临床研究[J].实用心电学杂志，2018，27（1）：38-42.

[6]陈伟伟，高润霖，刘力生，等.中国心血管病报告2013概要[J].中国循环杂志，2014，29（7）： 487-491.

[7]Bajaj A，Rathor P，Sehgal V，et al.Prognostic value of biomarkers in acute non-massive pulmonary embolism：a systematic review and meta-analysis[J].Lung，2015，193（5）：639-651.

[8]Lippi G，Sanchis-Gomar F，Cervellin G.Cardiac troponins and mortality in type 1 and 2 myocardial infarction[J].Clin Chem Lab Med，2017，55（2）：181-188.

[9]迟晔虹，王雪绒，梁娟，等.老年糖尿病合并冠心病患者的心率变异性分析[J].实用心电学杂志，2017，26（6）：420-423.

[10]Ifteni P，Barabas B，Gavris C，et al.Sudden cardiac death：autopsy findings in 7200 cases between 2001 and 2015[J].Am J Forensic Med Pathol，2015，38（1）：49-53.

[11]Iribarren C，Chandra M，Rana JS，et al.High-sensitivity cardiac troponin I and incident coronary heart disease among asymptomatic older adults[J].Heart，2016，102（15）：1177-1182.

[12]Mc Evoy JW，Chen Y，Ndumele CE，et al.Six-year change in high-sensitivity cardiac troponin T and risk of subsequent coronary heart disease，heart failure，and death[J].JAMA Cardiol，2016，1（5）：519-528.

[13]Jaruvongvanich V，Rattanadech W，Damkerngsuntorn W，et al.CK-MB activity，any additional benefit to negative troponin in evaluating patients with suspected acute myocardial infarction in the emergency department[J].J Med Assoc Thai，2015，98（10）：935-941.

[14]Sabatasso S，Mangin P，Fracasso T，et al.Early markers for myocardial ischemia and sudden cardiac death[J].Int J Legal Med，2016，130（5）：1265-1280.

[15]胡大一，丁荣晶.“胸痛中心”建设中国专家共识[J].中华危重症医学杂志（电子版），2011，4（6）：381-393.

[16]Su Q，Li L，Zhou Y，et al.Induction of myocardial PDCD4 in coronary microembolization-related cardiac dysfunction：evidence from a large-animal study[J].Cell Physiol Bio chem，2014，34（2）：533-542.

[17]Liu X，Cheng Y，Yang J，et al.An essential role of PDCD4 in vascular smooth muscle cell apoptosis and proliferation：implications for vascular disease[J].Am J Physiol Cell Physiol，2010，298（6）：C1481-C1488.

[18]Ge C，Song J，Chen L，et al.Atheroprotective pulsatile flow induces ubiquitin-proteasome-mediated degradation of programmed cell death 4 in endothelial cells[J].PLoS One，2014，9（3）：e91564.

[19]Sheedy FJ，Palsson-McDermott E，Hennessy EJ，et al.Negative regulation of TLR4 via targeting of the proinflammatory tumor suppressor PDCD4 by the microRNA miR-21[J].Nat Immunol，2010，11（2）：141-147.

[20]Bassan F，Bassan R，Esporcatte R，et al.Very long-term prognostic role of admission BNP in non-ST segment elevation acute coronary syndrome[J].Arq Bras Cardiol，2016，106（3）：218-225.

[21]史潔茹，田成俊，曾强，等.过敏性和冠心病猝死者心肌组织中肥大细胞类胰蛋白酶、脑利钠肽的表达[J].法医学杂志，2016，32（3）：161-164.

[22]Vogiatzis I，Dapcevic I，Datsios A，et al.A comparison of prognostic vaule of the levels of pro BNP and troponin T in patients with acute coronary syndrome（ACS）[J].Med Arch，2016，70（4）：269-273.

[23]Struthers AD，George J.High B-type natriuretic peptidehypertensives at target blood pressure：potential role of β blockers to reduce their elevated risk[J].Hypertension，2015，66（5）：927-932.