发酵蔬菜硝酸盐、亚硝酸盐消长变化及其相关性的研究

迟雪梅，王一茜，乔慧，荣金诚，迟乃玉，张庆芳*

1(大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连，116622)2(辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁 大连，116622)

发酵蔬菜作为一种传统的大众化消费食品，不仅含有蔬菜本身的营养成分，还有调节肠道微生态平衡等作用。但在发酵过程中也存在一些问题，其中最为严重的就是亚硝酸盐含量的超标，而亚硝酸盐的含量主要受硝酸盐含量的影响[1]。

硝酸盐除了作为食品添加剂外，还被认为是氮循环的一部分，在植物的生长发育过程中起重要作用。由于它的累积性质，硝酸盐成了蔬菜的重要组成部分[2-3]。绿叶蔬菜，如苋菜和普通白菜的硝酸盐污染情况最为严重[4-5]。人类接触的硝酸盐近80%来源于蔬菜消费，而在较小程度上与其他食物和水相关[6-7]。膳食硝酸盐基本上是惰性的，并且仅通过硝酸还原酶还原成亚硝酸盐，然后再形成N-亚硝基化合物中作为胺和(或)酰胺的反应物获得生物活性。硝酸盐还原成亚硝酸盐的主要途径是唾液、胃和血管[8]。

硝酸盐的毒性在很大程度上是不被表达的，但会被还原为对人体健康具有毒理学影响的亚硝酸盐、N-亚硝胺和各种其他氮化合物等代谢物质，前者更会增加绝经后妇女患乳腺癌的风险[9-11]。研究发现，摄入硝酸盐含量较高的蔬菜会增加人们患肠胃癌[12]、高铁血红蛋白症等疾病的几率[4]。当胃酸不足或患有胃肠道疾病时，胃肠道中的细菌把食入的硝酸盐还原成亚硝酸盐而中毒，所谓“肠原性紫绀症”就是如此[13]。因此，应该对蔬菜、发酵菜中硝酸盐的污染情况加以重视，减少硝酸盐的含量即降低了其还原成亚硝酸盐的危险[4]。

本研究通过自然发酵和接种发酵蔬菜，分析发酵菜中硝酸盐剩余量、菜中亚硝酸盐残留量、亚硝峰值及汤汁最低pH值之间的相关性，并希望通过生物技术、基因工程等手段，克隆表达1株既可以降解亚硝酸盐又可以降解硝酸盐的乳酸菌，而用其接种发酵，从根本上保证食品的安全。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Streptococcuslastic(A)；Lactobacillusleichmannii(B)；Lactobacilluscaseisubsp .rhamnosus(4号)；Streptococcuscremoris(5号)；Lactobacillusplantarun(8号)；A、5号为乳酸球菌，B、4号、8号为乳酸杆菌，以上菌株由辽宁省海洋微生物工程技术研究中心保藏。

MRS培养基[14]。

1.2 仪器与设备

超净工作台(HD-1360)，北京东联哈尔仪器制造有限公司；电子天平(SQ-HZT-50001)，江苏衡之泰；酸度计(pHB-4p)，美国哈希HACH公司；紫外可见分光光度计(UV-120-02)，日本SHIMADZU公司。

1.3 方法

1.3.1 蔬菜发酵工艺

把清洗过的甘兰叶片放在恒温水浴锅中，水温85～90 ℃，烫0.5～1 min，取出后迅速投入冷水中漂洗；之后放入筛筐中沥去表面水分；甘兰叶片切段3～4 cm，分别装入5个灭菌的玻璃瓶(500 mL)中，每瓶装量250 g，按实；在装紧甘兰的瓶中放一块无菌石块，重约80～100 g，配制20 g/L的盐水溶液，煮沸过滤，晾凉，每瓶注入325 mL；接种(对照：自然发酵；复合菌剂[15-17]：将已培养36 h的A，B，4号，5号，8号乳酸菌液，分别按A∶B∶8号=1∶1∶1，A∶B∶5号∶8号=1∶1∶1∶1，A∶B∶5号∶4号=1∶1∶1∶1组成3种混合乳酸菌剂10 mL，加入5个玻璃瓶中，菌液摇匀，无菌瓶盖密封；单菌种B：将已培养36 h的B乳酸菌液，分别按0.5%，1%，2%，3%和4%的接种量，接入5个玻璃瓶中，菌液摇匀，无菌瓶盖密封。于25 ℃保温发酵。检测硝酸盐、亚硝酸盐、总酸、pH值，重复3次。

1.4 测定指标及方法

硝酸盐、亚硝酸盐[18]：按GB 5009.33—2010测定，重复3次。

标准曲线的绘制：依据 GB 5009.33—2010，绘制亚硝酸盐的标准工作曲线，亚硝酸盐的线性方程为:y=0.760 97x+0.002 68(R2=0.999 6)。

总酸：把已知物质的量浓度的NaOH溶液注入事先已用该NaOH溶液润洗过的碱式滴定管，至刻度“ 0”以上，把滴定管固定在滴定管夹上。轻轻转动下面的活塞，使管的尖嘴部分充满溶液且无气泡。然后调整管内液面，使其保持在“0”或“0”以下的某一刻度，并记下准确读数。

把待测浓度的样品溶液注入事先已用该溶液润洗过的酸式滴定管，固定在滴定管夹上。轻轻挤压玻璃球，使管的尖嘴部分充满溶液且无气泡,然后调整管内液面，使其保持在“ 0”或“ 0”以下某一刻度，并记下准确读数。

在管下放一洁净的锥形瓶，从酸式滴定管放出25.00 mL 样品溶液，注入锥形瓶，加入2滴酚酞试液，溶液呈无色。然后，把锥形瓶移到碱式滴定管下，左手调活塞逐滴加入已知物质的量浓度的NaOH溶液，同时右手顺时针不断摇动锥形瓶，使溶液充分混合。随着NaOH溶液逐滴加入，锥形瓶里c[H+]浓度逐渐减小。最后，当看到加入1滴NaOH溶液时，溶液立即由无色变成浅红色，且反滴1滴样品溶液又变回无色,说明反应恰好进行完全。停止滴定，准确记下滴定管溶液液面的刻度，并准确求得滴定消耗的NaOH溶液体积。重复3次。然后根据有关计量关系，计算出待测的样品溶液的物质的量浓度、C(A)*V(A)=C(B)*V(B)，其中A(Acid)为酸，B(Base)为碱。

pH值：酸度计法，重复3次。

1.5 乳酸菌的活化

将乳酸菌分别接入MRS培养基进行复壮、活化。培养基在使用前经121 ℃灭菌15 min。然后在30 ℃培养24 h，传3代使其性状稳定。

1.6 数据统计分析

实验数据通过origin软件作图并进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 自然发酵

由图1可看出：在整个发酵过程中，随着腌渍时间的延长，菜中硝酸盐、汤汁pH值逐渐降低；总酸逐渐升高；亚硝酸盐出现升高、降解，再生高、再降解的现象。

图1 硝酸盐、亚硝酸盐、总酸、pH值的变化曲线Fig.1 The curve of nitrate, nitrite, total acid and pH

分析其原因：在发酵初期(汤汁的pH值6.8左右)适合硝酸盐还原酶产生菌(好氧)的生长，从而将菜中的硝酸盐大量地还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐含量升高[19-20]；随着氧的消耗，乳酸菌(兼性厌氧)大量生长，在产生乳酸同时也产生亚硝酸还原酶，进入了酶降解亚硝酸盐阶段；当汤汁pH值降至5.0左右(亚硝酸还原酶最适作用pH值)，会将亚硝酸盐大量分解(出现第1个峰)。随着酸的进一步增加，当汤汁pH值降至4.0以下时，亚硝酸还原酶失活，菜中亚硝酸盐又开始积累；但同时也进入了酸降解亚硝酸盐阶段，随后亚硝酸盐又被降解(出现第2个亚硝峰)[21]。

在图1所示的整个蔬菜发酵过程中，发酵21天，菜酸香味浓；醇厚柔和，有酯香及菜体清香，有香味，无异味，口感脆嫩；菜帮柔韧，叶有较大弹性，根部不烂，菜已腌渍成熟，原料中硝酸盐从869.06 mg/kg降至276.93 mg/kg。

2.2 复合菌剂接种发酵

接种由5个乳酸菌株组成的3个菌剂(AB58、AB45、AB8)进行蔬菜发酵，以自然发酵为对照。测发酵菜中硝酸盐、亚硝酸盐，发酵过程中汤汁亚硝酸盐、pH值，见图2、图3、图4。

图2 发酵菜中硝酸盐、亚硝酸盐含量Fig.2 The amount of nitrate and nitrite contained in fermented vegetables

图3 汤汁中亚硝酸盐含量的变化Fig.3 The change of nitrite contents in vegetable fermented broth

图4 汤汁中pH值的变化Fig.4 The change of pH contents in vegetable fermented broth

由图2可看出，成熟发酵菜中亚硝酸盐含量是：不接种(自然发酵)为2.67 mg/kg、接菌剂AB8为0.47 mg/kg、接菌剂AB45为0.36 mg/kg、接菌剂AB58未检出，如依次按大小可排序为 CK>AB8>AB45>AB58；成熟发酵菜中硝酸盐含量是：不接种(自然发酵)为232.06 mg/kg、接菌剂AB8为329.74 mg/kg、接菌剂AB45为422.13 mg/kg、接菌剂AB58为544.32 mg/kg，如依次按大小可排序为AB58>AB45>AB8>CK。

由图3可知，接种乳酸菌剂使发酵汤汁中亚硝酸峰值显著降低，不接种(自然发酵)为183.64 mg/kg、接菌剂AB8为47.37 mg/kg、接菌剂AB45为6.51 mg/kg、接菌剂AB58为0 mg/kg，如依次按大小可排序为CK>AB8>AB45>AB58。

图4可知，接种乳酸菌剂的菜发酵快，汤汁pH值始终比自然发酵菜的汤汁pH值低；发酵10 h，接菌剂的汤汁pH值降至4.0以下，不接菌剂(自然发酵)的汤汁pH值降至5.5左右；发酵终点最低pH值的大小顺序为CK>AB45>AB8>AB58，其值分别为3.53，3.08，2.87，2.80。

从以上分析还可知：亚硝酸盐峰值越大，硝酸盐剩余量越少；发酵终点pH值越高，亚硝酸盐峰值越大，发酵菜中亚硝酸盐残留量越多等现象。

接种不同菌剂的发酵菜，其汤汁的亚硝酸盐峰值与菜中亚硝酸盐残留量的相关系数r=0.9871(>r0.01)，线性相关显著；汤汁的亚硝峰值与菜中硝酸盐的剩余量的相关系数r=0.872 1(>r0.05)，线性相关显著；汤汁的最低pH值与菜中亚硝酸盐残留量的相关系数r=0.950 6(>r0.05)，线性相关显著。

2.3 单菌种接种发酵

由于复合菌剂的菌种数量及种类等都不同，可能会对各指标的相关性分析结果产生较大的影响。因此进行单菌种不同接种量的蔬菜发酵实验，进而对接种量、汤汁亚硝峰值、汤汁最低pH值，菜中硝酸盐剩余量、亚硝酸盐残留量等指标进行相关性分析，见表1和表2。

由表1和表2可知：亚硝峰值与亚硝酸盐残留量相关系数r1为0.892 5，亚硝峰值与硝酸盐剩余量相关系数高达r2为0.978 1，接种量与亚硝峰值相关系数r3为-0.923 0，接种量与亚硝酸盐残留量相关系数r4为-0.798 8，接种量与硝酸盐剩余量相关系数r5为0.937 6，接种量与最低pH值相关系数r6为-0.774 7，亚硝酸盐残留量与最低pH值相关系数r7为0.983 0；相关性大小顺序是|r7|>|r2|>|r5|>|r3|>|r1|>|r4|>|r6|。

表1 单菌种蔬菜发酵各指标相关性分析

表2 单菌种不同接种量与蔬菜发酵各指标的相关性分析

与r0.05=0.878 3和r0.01=0.958 7比可得如下结论：相关性极显著的是：亚硝酸盐残留量与最低pH值的相关性(|r7|>r0.01)，亚硝峰值与硝酸盐剩余量的相关性(|r2|>r0.01)；相关性显著是：接种量与硝酸盐剩余量相关性(|r5|>r0.05)，接种量与亚硝峰值相关性(|r3|>r0.05)，亚硝峰值与亚硝酸盐残留量相关性(|r1|>r0.05)；相关性不显著的是：接种量与亚硝酸盐残留量有负相关、但不显著(r0.05>|r4|)，接种量与最低pH值有负相关、但不显著(r0.05>|r6|)。

3 讨论与结论

3.1 指标相关性分析

见图1。在发酵菜环境中各指标的消长变化相互关联。蔬菜发酵过程中由于硝酸盐还原酶产生菌的作用，使菜中硝酸盐大量分解；随着发酵时间的延长，亚硝酸盐生成量越来越多；但由于乳酸菌的代谢产生亚硝酸还原酶和酸性物质，使亚硝酸盐被降解，出现了亚硝峰、亚硝酸盐残留和硝酸盐剩余。因此对蔬菜发酵的相关指标进行相关性分析，可知：在其他条件相同的情况下：如接种菌剂不同，其汤汁的亚硝峰值与菜中亚硝酸盐残留量有极显著的相关性(r=0.987 1>r0.01)，汤汁的亚硝峰值与菜中硝酸盐的剩余量有显著的相关性(r=0.872 1>r0.05)，汤汁的最低pH值与菜中亚硝酸盐残留量有显著的相关性(r=0.950 6>r0.05)；如接种量不同，亚硝酸盐残留量与最低pH值有极显著相关性(|r7|>r0.01)，亚硝峰值与硝酸盐剩余量有极显著相关性(|r2|>r0.01)，接种量与亚硝酸盐剩余量有显著相关性(|r5|>r0.05)，接种量与亚硝峰值有显著相关性(|r3|>r0.05)，亚硝峰值与亚硝酸盐残留量有显著相关性(|r1|>r0.05)。

3.2 硝酸盐剩余量分析

由图1、图2、图5所示，不论在自然发酵，还是接菌剂和不同接种量的成熟菜中都有大量硝酸盐剩余，其量达上百或几百mg/kg。根据1.232 mg/kg硝酸盐能转化为1 mg/kg亚硝酸盐来计[21]，将还有数百mg/kg的亚硝酸盐生成(摄入量达到0.2～0.5 g时可导致中毒，超过3 g时可致人死亡)[22]。有研究发现，97%亚硝酸盐是由硝酸盐转变而来[23]，硝酸盐会在口腔唾液的作用下变成亚硝酸盐进入人体[24]。由图2、图5还可看出，接种菌剂越复杂或接种量越大，越抑制了硝酸还原菌的生长[24]，使硝酸盐的剩余量也越多；反而自然发酵(不接种)的产品中硝酸盐剩余量相对较少。应对以上现象引起高度关注。

图5 不同接种量菜中硝酸盐与亚硝酸盐含量Fig.5 The content of nitrate and nitrite in different inoculation amount fermented vegetables

4 展望

根据本论文的研究和前期研究[15-17,25-26]，可以设计一个3段式发酵工艺，发酵初期为自然发酵，发酵中期接高产亚硝酸还原酶的乳酸菌，发酵后期接产酸的乳酸菌。此工艺生产的发酵菜即安全(硝酸盐少、亚硝酸盐少)、营养高、风味好。

乳酸菌无硝酸盐还原酶基因，不能把硝酸盐降解为亚硝酸盐；但乳酸菌有亚硝酸盐还原酶基因，能把亚硝酸盐还原为氮和氨等。如从大肠杆菌等菌中(非致病菌)调取硝酸盐还原酶基因转接在乳酸菌亚硝酸盐还原酶基因组上，构建出既有硝酸盐还原酶基因(能表达)又有亚硝酸盐还原酶基因的乳酸菌，可应用到酸奶、发酵菜、肉制品加工、青贮饲料等制品，用以清除人、畜体内及食品中去除亚硝酸盐，同时也清除其中的硝酸盐。

通过相关性分析结果可知：亚硝酸盐残留量与最低pH值有显著相关性，亚硝峰值与硝酸盐剩余量有显著相关性；因此在蔬菜发酵过程中可通过监测发酵液pH值和亚硝峰值，来预测和比较发酵菜中硝酸盐和亚硝酸盐的剩余、残留量等情况。

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