人线粒体转录终止因子3基因RNA干扰表达载体的构建筛选与干扰效果评价

梅雯，孙美涛，自加吉，王唯斯，杨勇琴，余敏，熊伟

1.大理大学 基础医学院，云南 大理 671000；2.云南大学 生命科学学院，云南 昆明 650091

线粒体转录终止因子（mitochondrial transcrip⁃tion termination factor，MTERF）是广泛存在于后生动物和植物中，参与线粒体基因复制、转录和翻译的一类高度保守的线粒体DNA（mitochondri⁃al DNA，mtDNA）结合蛋白，且具有相似的亮氨酸拉链结构[1]。研究表明，人类MTERF蛋白家族共有 4 个成员，即 MTERF1～MTERF4[2]。MTERF3 又被称为线粒体转录终止因子结构域1（mitochon⁃drialtranscription termination domain containing 1，MTERFD1），是MTERF蛋白家族中进化最保守的成员[3]。实验研究发现，敲除MTERF3基因的纯合子小鼠胚胎发育缺陷且导致胚胎死亡，说明MTERF3是哺乳动物胚胎发育过程中必不可少的重要调控因子[4]。Park等[5]首次报道哺乳动物MTERF3是线粒体DNA转录的负调控因子，能抑制线粒DNA双链的转录水平，减缓细胞能量的生产。同时，Roberti等[6]发现在果蝇D.Mel-2细胞中转染过表达D-MTERF3基因会导致线粒体基因转录水平的下降，也提示MTERF3是线粒体DNA转录的负调控因子。Hyvarinen等[7]的研究显示，在293T细胞内过表达人MTERF3蛋白能抑制mtDNA复制叉的形成，造成细胞内mtDNA拷贝量下降。Wrdenberg等[8]还发现，哺乳动物MTERF3不仅可以负性调节线粒体DNA转录，而且可以进一步调节线粒体中核糖体大亚基的组装，影响核糖体的生物合成。因此，人MTERF3不仅参与mtDNA转录，还参与mtDNA的复制和翻译调控过程。最近的研究显示，人MTERF3在各种不同类型的实体瘤，如肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌中均有基因扩增和过表达现象，其蛋白质表达异常可能参与了恶性肿瘤的发生发展和转移过程[9-11]。在本研究中，我们设计并构建了4个靶向MTERF3基因的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）干扰表达载体，并转染宫颈癌HeLa细胞，检测其对人MTERF3基因mRNA和蛋白质水平的干扰效率，为进一步探讨人MTERF3在恶性肿瘤细胞发生发展中的作用机制，以及肿瘤基因治疗中的应用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌HeLa细胞株由中国医学科学院昆明生物医学研究所廖国阳研究员惠赠；克隆宿主菌大肠杆菌DH5α购自Biomed公司；shRNA干扰表达载体psi-U6.1购自Invitrogen公司。

DMEM高糖液体培养基、Opti-MEM液体培养基和胎牛血清购自Gibco公司；限制性核酸内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、T4DNA连接酶、逆转录试剂盒、SYBR premix ExTaq购自TaKaRa公司；0.05%胰蛋白酶、青链霉素、Western/IP细胞裂解液、BCA蛋白质定量试剂盒、ECL化学发光液、Li⁃pofectAMINE 6000转染试剂购自Beyotime公司；PVDF膜购自Millipore公司；HQ高纯度质粒DNA提取试剂盒、TRIzol试剂购自Invitrogen公司；Trans2K plusDNA marker、EasySee Western marker购自TransGen公司；兔抗人β-tubulin单克隆抗体、兔抗人MTERF3多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自Abcam公司；酵母提取物、DEPC水、蛋白胨及其他生化试剂购自上海生工生物工程公司；PCR引物合成和DNA测序由北京擎科生物工程公司完成。

1.2 人MTERF3基因靶向寡核苷酸的设计和制备

遵循shRNA设计原则[12]，依据MTERF3基因（GenBank ID：51001）的cDNA序列，利用Oligoen⁃gine在线软件设计4个shRNA干扰序列（表1）。将候选序列通过美国生物技术信息中心（NCBI）进行Blastn同源性分析，未发现包含该序列的其他基因，说明4个靶点特异性较好。根据psi-U6.1载体要求，设计的每条序列两端包含EcoRⅠ和BamHⅠ识别位点，由北京擎科生物工程公司合成。

1.3 RNA干扰表达载体的构建

用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切psi-U6.1载体（37℃，3 h），经1%琼脂糖胶电泳后胶回收载体大片段；将合成的寡聚核苷酸互补链分别用退火缓冲液［10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA］溶解，然后置于沸水中自然退火，形成带有黏端的双链DNA。将退火产物用T4DNA连接酶分别连接入psi-U6.1载体的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，构建4个psi-MTERF3 shRNA干扰表达载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，每个转化平板分别挑取4个氨苄西林（Amp）抗性单克隆进行PCR鉴定和DNA测序鉴定。PCR鉴定上游引物为5′-CCGACAACCACTA CCTGA-3′，下 游 引 物 为 5′-CTCTACAAATGTGGT ATGGC-3′；DNA 测序上游引物为 5′-ATGCTTAC CGTAACTTGAAAG-3′，下 游 引 物 为 5′-CTCTACA AATGTGGTATGGC-3′。将构建的4个重组干扰质粒分别命名为psi-hMTERF3-1～psi-MTERF3-4。

1.4 细胞培养与细胞转染

HeLa细胞用DMEM完全培养基（10%胎牛血清，1%青链霉素双抗）于37℃、5%CO2条件下培养，按1×106/孔接种于6孔板，分为空白对照组、阴性对照组（psi-U6.1空载体）、psi-hMTERF3-1组、psi-MTERF3-2组、psi-MTERF3-3组和psi-MTERF3-4组，每组设置3个重复。待细胞至70%～80%汇合时进行转染，转染前将DMEM完全培养基更换为无血清培养基，按LipofectAMINE 6000说明书进行脂质体介导的瞬时转染，48 h后在荧光倒置显微镜下观察细胞形态，拍摄绿色荧光蛋白的表达情况[13]。

表1 靶向人MTERF3基因的4条shRNA序列信息

1.5 荧光显微镜观察转染效率

由于质粒携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，在质粒转染细胞后24～48 h，用荧光显微镜在488 nm波长紫外光激发下观察，可发现转染细胞内由于表达EGFP而发出明亮的绿色荧光，未转染细胞中则未见任何荧光。经过连续视野计数阳性的细胞数，共观察20个视野，可计算质粒转染效率：细胞转染效率=（表达阳性的细胞数/计数细胞总数）×100%[14]。

1.6 real time RT-PCR检测MTERF3 mRNA表达水平

瞬时转染HeLa细胞48 h后，用TRIzol试剂提取各组细胞的总RNA，反转录为cDNA，通过real time RT-PCR检测细胞样品中目的基因MTERF3和内参基因GAPDH的表达量，实验重复3次。目的基因MTERF3及内参基因GAPDH的引物序列分 别 为 MTERF3-F（5′-ATATCCTCTGACAATTGC T-3′）和 MTERF3-R（5′-TCCACTGAAAAGTTCAG C-3′）、GAPDH-F（5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT C-3′）和 GAPDH-R（5′-GAGATGGTGATGGGATTT C-3′）。根据real time RT-PCR反应曲线得到各样品目的基因和内参基因的数值循环数值（Ct），采用Ct方法进行相对定量。以转染阴性干扰载体的样品为对照，比较各瞬时转染干扰载体组样品目的基因的表达，并计算干扰效率[15]。ΔΔCt=（待测样品目的基因的Ct平均值－待测样品内参基因的Ct平均值）－（对照样品目的基因的Ct平均值－对照样本内参基因的Ct平均值）。基因的表达量 F=2-ΔΔCt，目的基因的沉默效率=1-2-ΔΔCt。

1.7 Western印迹检测MTERF3蛋白质表达水平

瞬时转染HeLa细胞48 h后，用Western/IP细胞裂解液提取各组细胞总蛋白质，再用BCA总蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度后上样，进行SDS-PAGE，电泳至溴酚蓝达到分离胶底部，半干转印法转膜后，常温下用含5%脱脂奶粉的TBST溶液中于脱色摇床上轻轻摇动封闭1 h。室温孵育一抗，一抗为兔抗人MTERF3多克隆抗体（1∶1000）或兔抗人β-tubulin单克隆抗体（1∶2000），将膜条放置平皿中于脱色摇床上轻轻摇动孵育2 h；用TBST（含20%Tween-20）缓冲液摇床摇动洗膜2次，每次10 min；再进行二抗孵育，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶5000稀释），同上述方法室温孵育1 h，TBST洗膜2次，每次10 min；最后加ECL发光剂作用约15 s，用化学发光成像仪曝光并拍照。

1.8 统计学分析

用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，定量资料以x±s表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD⁃t检验，P≤0.05为差异有统计学意义，P≤0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 人MTERF3基因shRNA干扰载体的构建与鉴定

将合成的4条寡聚核苷酸片段与psi-U6.1载体连接并转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆进行PCR鉴定，重组质粒可得到415 bp的产物，空质粒扩增得到376 bp的产物，结果显示，PCR扩增产物大小均与预期片段一致，证明已插入目的片段（图1）。将含重组质粒的大肠杆菌扩增后提取质粒，并将阳性克隆送北京擎科公司测序，经过DNA测序和Blastn比对分析，表明重组克隆中插入目的片段序列与设计的寡聚单链DNA序列完全一致，无碱基突变（图2）。以上结果证实4个重组干扰表达载体均构建成功，分别命名为psi-MTERF3-1、psi-MTERF3-2、psi-MTERF3-3和psi-MTERF3-4。

2.2 转染后干扰载体psi-MTERF3在细胞中的荧光观察

干扰载体瞬时转染HeLa细胞48 h后，在荧光显微镜观察下观察，各组细胞均可见较多绿色荧光蛋白表达（图2），提示细胞中有转染的外源基因表达，说明干扰载体已成功地瞬时转染HeLa细胞。经多视野阳性细胞计数，计算重组质粒转染效率为75%±4.6%。

2.3 干扰表达载体对MTERF3基因 mRNA的沉默效率

以未转染的HeLa细胞为空白对照，real time RT-PCR检测HeLa细胞分别转染4个shRNA干扰载体和psi-U6.1（阴性对照）后人MTERF3基因mRNA的表达情况。结果显示，与对照组相比，阴性对照组不能降低MTERF3mRNA的表达，4个shRNA干扰表达载体均能够不同程度地降低MTERF3mRNA的表达，干扰效率分别为51.3%、58.0%、50.2%和70.1%，提示psi-MTERF-3、psi-MTERF-4质粒的干扰效果最优（图4）。

2.4 干扰表达载体对MTERF3蛋白表达的沉默效率

以未转染的HeLa细胞为空白对照，Western印迹检测HeLa细胞分别转染4个shRNA干扰载体、psi-U6.1（阴性对照）后人MTERF3蛋白的表达。结果显示（图5），各组的β-tubulin表达未受影响，转染空载体的HeLa细胞中MTERF3蛋白的表达未见差异，转染4个shRNA干扰表达载体后的干扰效率分别为52.3%、60.1%、50.2%和72.2%，psi-MTERF-3、psi-MTERF-4重组载体对MTERF3蛋白表达的抑制最有效。

图1 psi-MTERF3质粒图谱与PCR鉴定图

图2 4个psi-MTERF3质粒的DNA测序图谱

3 讨论

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在生物体细胞内，由反义RNA与正链RNA形成双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA），特异性抑制靶基因表达的现象，是一种转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）[16]。RNAi是在RNA水平调节基因表达的一种方式，对细胞防御病毒的感染、修复遗传损伤及调节正常基因功能具有重要作用。小干扰RNA（small interfer⁃ence RNA，siRNA）介导的转录后水平的基因沉默针对靶向基因的外显子序列，而对其启动子或内含子序列没有效应[17]。与核酶技术、翻译技术等基因沉默技术相比，RNAi具有高特异性、高效性、高稳定性、可传播性的特点，而且其抑制效应可垂直传递多代[18]。因此，RNAi技术在基因功能研究和基因治疗方面的应用越来越多。

图3 干扰质粒转染HeLa细胞后绿色荧光蛋白表达情况

图4 干扰载体转染HeLa细胞后MTERF3 mRNA的相对表达n=3；*P＜0.05

近年来，随着人们对线粒体转录调控机制和人类线粒体遗传病研究的深入，MTERF蛋白家族日益受到重视。人MTERF3主要抑制mtDNA的表达，可以降低细胞能量的合成，为糖尿病、心脏病、帕金森症和恶性肿瘤等疾病的治疗开辟新思路。人MTERF3是线粒体基因表达和氧化磷酸化活性的负调控因子，其作用类似于细胞癌基因，对肿瘤细胞的生长及转移具有促进作用[5,11]。现有研究表明，人MTERF3在非小细胞肺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌和乳腺癌等恶性肿瘤组织中呈高表达，但由于样本量小、抽样误差等原因，其结论有待进一步证实[9-11]。前期研究中，我们利用Oncomine和TCGA数据库分析人MTERF3基因mRNA在宫颈癌组织及正常宫颈组织中的表达情况，结果显示人MTERF3基因在宫颈癌组织中的mRNA表达水平显著高于正常宫颈组织（P＜0.05），进一步证实MTERF3基因在肿瘤组织中高表达，促进肿瘤的生长和增殖。

shRNA是由核酸内切酶将外源或内源dsRNA加工成21～23 nt的双链RNA，是RNAi的中间产物，也是RNAi的关键因素[19]。本研究中所用的psi-U6.1是一个能在真核细胞中表达的shRNA干扰载体，且携带EGFP报告基因，可用于观察和计算细胞的转染效率。根据RNAi设计原则，本研究设计4条shRNA序列进行筛选，构建靶向MTERF3基因的shRNA真核表达载体，其转录产物可在细胞内形成shRNA，此shRNA随后被加工成siRNA而降解靶基因mRNA，从而达到阻断靶基因表达的目的。将4个重组质粒用脂质体介导瞬时转染HeLa细胞，分别以GAPDH和β-Tubulin为内对照，MTERF3基因在mRNA水平和蛋白质水平均被显著抑制（P＜0.05）。通过检测和筛选发现，4条特异性shRNA序列中，以psi-MTERF-3、psi-MTERF-4转染后对MTERF3基因的干扰效果最好，可以作为研究靶向MTERF3的RNAi的优先考虑序列，也为以MTERF3为靶基因的RNAi肿瘤治疗提供了可靠的实验基础，但还须进行深入的药物实验及动物体内实验来确证其有效性。随着分子生物学的发展，对MTERF3基因的研究不断深入，但主要侧重于线粒体转录调控方面，有关MTERF3表达与线粒体疾病的关联，以及MTERF3表达与人类恶性肿瘤发生发展的关系还待深入探讨。后续，我们拟从干扰MTERF3基因表达对肿瘤细胞线粒体氧化磷酸化活性和细胞恶性生物学行为的影响等方面展开深入研究，为进一步阐明MTERF3基因在恶性肿瘤发生发展中的作用机制奠定基础。

图5 干扰载体转染HeLa细胞后MTERF3蛋白的相对表达n=3；*P＜0.05

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