人主动脉夹层血管平滑肌细胞的培养和鉴定

卢 琳， 吴锡阶， 彭 华， 陈良万

主动脉夹层(aortic dissection, AD)是一种十分凶险的疾病，进展快，病死率高[1]，治疗以外科手术为主。一方面，虽然近几年外科手术技术得到不断创新和改进，但AD的总体死亡率仍较高；另一方面，AD的发现率不断上升，在发达国家，AD每年新增病例约10.4例/百万人[2]。中国虽没有大规模流行病学统计资料，但近年来随着诊断技术的不断进步，AD的发现率也越来越高，而且引起AD发病的危险因素，如高血压病和动脉粥样硬化等疾病的发病率也逐年增加，加上我国人口基数大，AD的新增病例数不可忽视。因此，了解AD的发病机制并进行预防就显得尤为重要。

简单地理解，AD就是血液通过血管壁内膜出现的破口进入血管壁中层，使得中层裂开。而血管壁中层的主要成分就是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)。既往研究表明，VSMC体外培养传代后，其生物学特性仍然接近体内细胞[3]。因此，对人AD的VSMC进行体外培养，同时模拟体内干预条件，观察细胞的分子生物学特性变化，是研究AD血管壁生物学行为和AD发生发展过程的重要手段。本研究以组织块贴壁法培养原代细胞为基础，总结一种简单、方便、可靠的人AD VSMC原代培养方法。

1 材料与方法

1.1材料 VSMC培养基及细胞冻存液(美国Sciencell公司)；胎牛血清(法国Scitecher公司)；0.25%胰蛋白酶(美国Gibico公司)；Hank’s液(美国Genview公司)；一抗：α-SMA单克隆抗体、Ⅷ因子抗体，二抗：Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG免疫荧光二抗(英国Abcam公司)；考马斯亮蓝R250染液(美国Sigma公司)。

1.2AD的VSMC的体外培养

1.2.1AD血管的获取 本研究方案通过医院伦理委员会审查，实验研究符合《赫尔辛基宣言》中提出的伦理原则。所有受试者均签署书面知情同意书。将患者行手术治疗时清除的病变血管放入含VSMC培养基的无菌容器内，四周置冰，迅速送入实验室。从血管取下到开始培养的时间以不超过2 h为佳。

1.2.2VSMC的原代培养 在超净工作台中取出无菌容器放于冰面上，用Hank’s液将夹层血管表面的血液反复冲洗干净，用湿棉签轻轻擦拭血管内膜，尽量将内膜清除干净，再用镊子和眼科剪清除血管外膜。将处理好的血管放入无菌培养皿，加入少量培养基，使血管保持湿润状态。将血管中层剪成1 mm左右的组织块，再用吸管将组织块移入25 cm2的塑料培养瓶中，组织块间隔3～5 mm，待培养瓶底部均匀贴满组织块后，轻轻翻转培养瓶，使培养瓶底朝上。向培养瓶内加入6 mL平滑肌细胞培养基[每500 mL的培养基配有10 mL的胎牛血清、5 mL平滑肌细胞生长因子(100×)和5 mL 的青霉素/链霉素溶液(100×)]，拧紧瓶盖，将培养瓶放于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育3 h，待组织块贴附于瓶底后，小心翻转培养瓶，使得组织块被培养液充分覆盖。在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育。7 d后取出培养瓶，更换培养基，观察VSMC的生长情况。此后隔天更换细胞培养基，直至细胞长至融合成片，进行传代。

1.2.3VSMC的传代培养 在融合成片的原代VSMC换液后的第2天，吸除原培养液，用无菌的PBS液轻轻冲洗细胞2遍，再用1 mL 0.25%的胰蛋白酶在37 ℃下消化2 min，待细胞变圆浮起后，加入6倍体积新鲜的VSMC培养液终止消化，并用无菌巴氏吸管吸取细胞培养基轻轻吹打瓶底，使细胞完全脱离瓶底，同时打散细胞，使其均匀悬浮。用细胞计数板在倒置显微镜下计数，调整细胞密度为1.0×105mL-1，吸取5 mL传入新的培养瓶中，过夜，待细胞贴壁后更换细胞培养基，此后隔天更换细胞培养基，每次换液量为4 mL。待细胞长至融合后可再传代。

1.2.4VSMC的冻存 当细胞长至90%以上融合时，可将细胞冻存。按传代方法将细胞消化完后，将细胞悬液移入无菌离心管，1 500 r/min下离心5 min，弃去上清，加入1 mL细胞冻存液，轻轻混匀成细胞悬液，移入2 mL无菌冻存管中。将细胞冻存管先放入4 ℃冰箱10～20 min，然后放入室温的细胞冻存盒内，密闭冻存盒的盖子后，放入-80 ℃冰箱过夜，第2天将细胞冻存管转移入液氮罐长期保存。

1.3VSMC的观察与鉴定

1.3.1细胞生长情况的观察 将贴壁生长的VSMC直接置于倒置显微镜下观察，记录细胞的生长状况及形态，并拍照记录。

1.3.2细胞考马斯亮蓝染色 将培养瓶中的VSMC接种到放有无菌玻片的6孔培养板中进行爬片培养，3 d后吸掉培养基，DPBS冲洗2次，经2%的多聚甲醛预固定，1% Trion X-100 4 ℃处理30 min，4%多聚甲醛室温固定后，用0.2%考马斯亮蓝R250染色，二甲苯透明，树胶封片，显微镜下观察并拍照。

1.3.3细胞α-SMA和Ⅷ因子免疫荧光染色 对细胞爬片进行4%多聚甲醛固定，用正常非免疫血清封闭后，依次加入一抗体(a-SMA 1∶500稀释、Ⅷ因子1∶100稀释)、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(1∶200稀释)和新鲜配制的甘油封闭液(甘油与PBS的体积比为9∶1)封片，避光保存。封片后再置于倒置显微镜下观察并拍照。

1.3.4透射电镜观察 细胞消化离心后，弃上清，对细胞进行固定、脱水、包埋、固化、切片、染色，最后在透射电镜(JEM-1200EX，日本电子公司)下观察。

2 结 果

2.1原代VSMC的培养情况 贴壁培养第7天，倒置显微镜下可见少量细胞从组织块的边缘迁移出来，新长出的细胞与组织块呈垂直方向生长，长梭形，有多个细胞突起。随着培养天数的增加，组织块周围细胞密度逐渐增大，并向四周生长，直至与相邻组织块长出的细胞融合。从细胞开始萌出到生长至融合，一般需要3～4周。细胞呈现典型的“峰谷状”生长，即一些地方细胞呈多层生长，细胞之间相互接触重叠，另一些地方细胞却生长稀疏，呈单层排列，有些地方甚至无细胞生长。细胞呈长梭形，有多个突起，胞质丰富，均质透明，细胞核呈卵圆形或圆形居中(图1)。

2.2原代VSMC的传代情况 VSMC可连续传代，3～5 d可达90%以上融合而进行再次传代。6代以内的VSMC在传代周期和生长特征上无明显变化，细胞呈束状排列，呈现“峰谷状”生长。6代以后的细胞生长速度明显减慢，甚至无法融合，而且细胞体积变大，其内空泡明显增多，出现老化现象(图1D)。

2.3VSMC考马斯亮蓝染色 VSMC经考马斯亮蓝染色后，光镜下可见细胞呈长梭形，有多个突起，胞质内可见沿细胞长轴排列的微丝，核呈椭圆形或圆形，有些细胞核内可见多个核仁(图2)。

2.4VSMC α-SMA和Ⅷ因子免疫荧光染色 经α-SMA免疫荧光染色后的VSMC呈长梭形，多突起，胞质内可见被染成绿色的细肌丝沿细胞长轴密集排列，几乎布满整个细胞，胞质不染色；VSMC Ⅷ因子免疫荧光染色阴性(图3)。

2.5VSMC电镜鉴定 在电镜下可见胞质内有吞饮小泡和大量沿细胞纵轴排列的肌丝，呈现典型收缩表型特征，证实所培养的细胞为VSMC(图4)。

VSMC:血管平滑肌细胞. A：贴壁培养细胞开始从组织块边缘迁移出来( ×40)；B：贴壁培养细胞在组织块周围开始增殖，细胞数量变多( ×40)；C：贴壁培养细胞生长至基本融合，呈现典型“峰谷状”( ×100)；D：第7代细胞体积变大，胞内空泡增多，出现老化现象( ×100).图1 原代VSMC的贴壁培养和传代Fig 1 Adhenrent culture of primary human AD VSMC

VSMC:血管平滑肌细胞.图2 VSMC考马斯亮蓝染色( ×400)Fig 2 Coomassie brilliant blue staining of VSMC( ×400)

3 讨 论

机械牵张已经被证明是哺乳类动物细胞、组织和器官结构与功能的重要调节因子，能诱导细胞增殖、肥大和凋亡，而细胞的这些过程直接影响了动脉粥样硬化、高血压病和血管再狭窄等疾病的发生和发展[4]。VSMC是主动脉中层最重要的组成部分，主要功能是感受机械牵张[5]。血压的升高能使血管壁机械张力增加。在欧美国家，高血压病和动脉粥样硬化是AD最常见的病因[6-9]。我国目前还没有相关的流行病学资料，但在临床工作中发现，大部分AD患者(70%～90%)都合并高血压病。随着我国人口的老龄化以及高血压病发病率的逐年升高，高血压病已成为我国AD发病的最主要原因[10-11]。因此，人AD的VSMC的体外培养和传代并对其进行牵张，对研究AD的细胞生物学变化，从而进一步研究AD的发病机制有重要的意义。

VSMC:血管平滑肌细胞. A～C：α-SMA免疫荧光染色； A1～C1：Ⅷ因子免疫荧光染色； A，A1：细胞质染色； B，B1：细胞核染色； C，C1：细胞质和细胞核同时染色.图3 VSMC α-SMA及Ⅷ因子免疫荧光染色Fig 3 VSMC α-SMA and Ⅷ factor immunofluorescent staining

VSMC:血管平滑肌细胞. 图4 VSMC在透射电镜下的表现Fig 4 The appearance of VSMC under transmission electron microscopy

受限于取材，目前很多实验室仍采用猪、兔、鼠等动物的血管进行VSMC的培养和传代，但动物和人属于不同物种，在生物学上存在很大差异。也有采用人脐动脉或者股动脉血管进行VSMC培养[12-13]，但这些血管均属于外周血管，不能代表主动脉血管所具有的特点，而且取材困难。本实验基于笔者科室在临床中收集大量手术治疗的AD病例，以术中切除的AD血管为原料，采用组织块贴壁法成功地培养出原代人AD的VSMC，并进行传代培养。

VSMC原代培养的方法有很多，目前主要使用的有酶消化法和组织块贴壁法两种。实验初期，笔者试图采用Ⅰ型胶原蛋白酶或者含EDTA的0.25%胰酶消化AD血管[14]，但效果不佳，消化时长很难控制。消化时间短时细胞量太少；消化时间长时，细胞受损厉害，接种后成功率不高。究其原因，可能是人主动脉血管壁的厚度明显大于动物，并且其中层组织非常紧实，不易被消化；也可能是操作过程中的某个步骤出现疏忽，影响了结果。此外，人VSMC的培养难度也大于动物。因此，笔者改用组织块贴壁法培养，发现该方法操作简单，技术难度不大，细胞生长率高，一旦传代可获得大量的细胞，可为后续研究提供充足的细胞。

虽然VSMC的表型多样，具有显著的不均一性，但均表达α-SMA[15-16]。笔者培养的细胞通过免疫荧光检测可见α-SMA的强表达，而Ⅷ因子免疫荧光染色阴性，考马斯亮蓝染色和电镜下均可见细胞内大量沿纵轴排列的肌丝，说明所培养的细胞为收缩表型的VSMC，而非成纤维细胞或内皮细胞。

笔者在细胞培养过程中有几点体会：(1)不论是取材还是细胞培养，所有操作都应严格遵循无菌原则。(2)AD血管从人体取下后，应尽早送入实验室接种，2 h内最佳，不宜超过4 h,但如果放入细胞培养液中，则可以在4 ℃下过夜保存。(3)修剪组织块时尽量去除内膜和外膜，以提高纯度。由于AD血管壁中层组织很厚，经常夹带部分中层组织，修剪时注意减少牵拉，以减少对细胞的损伤。(4)组织块大小以1 mm为宜。太大会影响组织块内部细胞向外迁移，太小对组织块的损伤大，细胞不易迁移出来。(5)组织块贴壁间距以3～5 mm为宜，太稀疏时细胞融合时间过长，太密时培养液的营养消耗大，无法支持7 d。(6)贴壁时，将组织块蘸取细胞培养基后贴在培养瓶底部，贴壁时间以组织块贴住瓶底而周围的培养基未干涸为准，一般为3 h。如果贴壁超过6 h，组织块周围的培养基干涸，会影响细胞迁移的成功率。(7)开始培养的7 d之内，尽量不要移动培养瓶，不要观察，也不要更换培养基，以免影响细胞迁移。(8)关于细胞感染：只要在取材和操作时注意无菌原则，一般不会出现感染。(9)在相同培养条件下，年龄小的患者较年龄大的患者组织块更具增殖能力，细胞向外迁移快，长满融合的时间短，传代时间也短。(10)细胞传代时，胰酶消化的时间不能固定，应该适时在倒置显微镜下观察，待细胞变圆浮起后及时终止消化。

笔者应用组织块贴壁培养的方法，成功地在体外培养了人AD的VSMC，为今后研究AD的发病机制提供良好的实验基础。该方法方便，简单，技术要求不高，易于推广，在人AD疾病的研究中具有重要的研究价值。