橙皮素标准样品的研制

宋祥云，刘金宇，耿岩玲，林云良，付瑞明，崔莉，王岱杰*

(1. 山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东 济南 250014；2. 鲁南制药集团股份有限公司，山东 临沂 276006)

橙皮素(5, 7, 3′-三羟基-4′-甲氧基-黄烷酮)是一种重要的黄酮类化合物，具有独特的药理活性，广泛应用于医学的各个领域[1]。橙皮素具有健胃、祛痰、镇咳、驱风、利尿、抗病毒、止逆和止胃痛等功效。现代药理研究表明，橙皮素还具有抗氧化[2-4]、扩张血管、降血脂[5]、抗癌[6-9]、抗炎[10]、改善血脑屏障[11-12]等多种药理活性。

图1 橙皮素化学结构式Fig. 1 The chemical structure of hesperetin

橙皮素作为一种重要的药物原料，在自然界中分布广泛，同时也是多种植物产品的重要质量控制指标。目前市场上橙皮素以对照品为主，纯度参差不齐，未按照国家标准进行均匀性、稳定性和定值实验，最终结果没有不确定度评价，样品也不具有溯源性。因此，为了满足橙皮素及相关产品的检测需求，保证检测结果的准确性、可比性和溯源性，本文按照GB /T 15000. 3—2008标准样品工作导则[13]，成功研制出了橙皮素国家标准样品(图1)。

1 实验部分

1.1 仪器

R-3型旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；SCIENTZ-10N型冷冻干燥仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)； LC-6A型制备液相色谱仪(日本岛津公司)；WRS-1B型数字熔点仪(上海精密科学仪器有限公司)；UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；INOVA 600 MHz核磁共振波谱仪(美国瓦里安公司)；6520 Q-ToF型液质联用仪(美国安捷伦公司)；STA 449FC同步热分析仪(德国耐驰公司)。

1.2 试剂与原料

柱层析硅胶、GF254薄层硅胶板(青岛海洋化工厂)；高效液相色谱用甲醇为色谱纯(美国天地公司)，水为重蒸水，其他试剂为分析纯；橙皮素对照品(成都德思特生物技术有限公司)。

陈皮药材购自济南建联中药店，经山东省中医药大学李佳教授鉴定为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco的干燥成熟果皮，样本存放于山东省分析测试中心。

1.3 样品制备

1.3.1 橙皮素粗提物的提取

陈皮药材粉碎至40目，95%乙醇加热回流药材3次，每次3 h，抽滤，减压浓缩至无醇味，加水分散，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取，减压浓缩，分别得到石油醚和乙酸乙酯浸膏，乙酸乙酯浸膏冰箱保存备用。

1.3.2 橙皮素的富集

将乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯溶剂体系梯度洗脱，分瓶收集，薄层色谱和HPLC监测，橙皮素对照品比对，收集橙皮素含量较高的组分，减压浓缩。

1.3.3 制备液相色谱分离

图2 橙皮素单体的制备液相色谱图Fig. 2 Chromatogram of hesperetin purified by prep arative HPLC

1.4 纯度分析方法

1.4.1 高效液相色谱分析

1.4.2 薄层鉴别

1.4.3 热重分析

精密称取样品5 mg，置于热重用坩埚中，热重条件：初温 30 ℃，最终温度 600 ℃，升温速率10 ℃/min，气体N2，流量100 mL/min。

1.5 结构表征

橙皮素单体的结构表征采用紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)和核磁共振(NMR)等技术。UV 法的测试溶剂为甲醇，扫描范围为200～400 nm；IR法采用KBr压片，扫描波数为400～4 000 cm-1；MS为电喷雾离子源，载气温度为300 ℃，载气流速为10 L/min，普氮为载气，毛细管电压为4.0 kV，扫描范围m/z为100～1000；NMR法 的氘代试剂为CDCl3。

1.6 均匀性检验

1.7 稳定性检验

橙皮素样品储存温度为0～4 ℃，考察样品的1年稳定期，分5个时间段监测，按1.4.1中规定方法进行分析，样品纯度读取采用峰面积归一化法，每份样品测定6次，统计分析采用t检验法[13]。

1.8 定值

根据工作导则，标准样品的定值采用8 家实验室协作进行的方法。随机抽取样品24瓶，每家定值实验室寄出样品3瓶，每瓶测定2次，协作实验室共出6个检测结果，按1.4.1中规定方法进行分析，样品纯度以峰面积归一化法读取[13-14]。

2 结果与讨论

2.1 纯度分析

图3 橙皮素等度洗脱HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatogram of hesperetin by isocratic elution

2.2 结构表征

2.3 均匀性检验

将结果进行F检验，进行数据统计，确定橙皮素样品的均匀性，结果见表1和表2。

表1 均匀性检验数据Table 1 Results of homogeneity test

表2 方差分析数据Table 2 Results of variance analysis

瓶间方差的计算公式：

则瓶间标准偏差为：

u均=sbb=0.03%，

其中，u均为均匀性检验不确定度。

F值的计算公式：

F=MS瓶间/MS瓶内=2.16。

以组间自由度υ1=9和组内自由度υ2=20为变量查F临界值表，可知F0.05(9，20)=2.39，由于F值小于F临界值，因此所研制的橙皮素标准样品具有良好的均匀性。

2.4 稳定性检验

采用t检验对稳定性结果进行统计分析，采用直线模型，观察斜率值变化情况，并进行预测，结果见表3。

表3 稳定性检验数据Table 3 Results of stability test of

斜率计算公式如下：

截距计算公式如下：

直线模型的标准偏差：

则s=0.20%。

斜率相关不确定度计算公式如下：

查表得自由度为n-2和95%置信水平(p=0.95)分布的t因子为3.182。

由于斜率变化的绝对值|b1|

因此，斜率变化不显著，即橙皮素标准样品在1年内稳定性良好。

稳定性检验的不确定度为：

u稳=Sb×t=0.11%。

其中，u稳为稳定性检验不确定度。

2.5 定值

根据各个协作实验室的反馈结果，进行数据的统计分析，并最终确定橙皮素标准样品的标准值和不确定度统计结果见表4。

表4 协作定值数据Table 4 Results of cooperative certification

测定结果总平均值的计算公式如下：

实验室平均值的标准偏差为：

总平均值标准偏差为：

则多家实验室联合定值引入的不确定度为：

其中，u定为定值不确定度。

橙皮素标准样品的不确定度有如下三部分组分：(1)均匀性检验不确定度；(2)稳定性检验不确定度；(3)定值不确定度，这三部分不确定度分量互不相关，需将三种不确定度合成，即合成不确定度(U合成)为：

U合成2= u均2+ u稳2+ u定2。

代入数据计算得U合成=0.13%。

置信区间95%时，k=2。

则橙皮素标准样品的扩展不确定度：

U扩展=2U合成=0.13%×2=0.26%。

3 结论

本研究针对橙皮素及相关产品缺乏国家标准样品的现状，严格按照国标规定的标样样品研制规则，成功地研制出橙皮素标准样品，并顺利通过了专家验收。研制过程中对标准样品的均匀性进行考察，并进行方差分析；稳定性检验采用直线模型，并进行了t检验法考察；定值采用多家实验室协作，对定值结果进行统计分析。根据三个方面引入的不确定度，进行了不确定度的合成和扩展，获得了标准值为98.78%，置信度95%的不确定度为0.26%的橙皮素国家标准样品，具有样品溯源性，可用于相关产品的检测方法评定和含量测定，填补了橙皮素标准样品的国内外空白。

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