高大鬼针草的形态与显微鉴定

郑晓文，邴帅，刘政，陈文华，谭会颖，徐凌川

(山东中医药大学药学院，山东 济南 250355)

鬼针草属(BidensL.)植物隶属于菊科(Compositae)管状花亚科(Arduoideae Kitam.)向日葵族(Trib.Heliantheae Cass.)，为一年生的草本植物。鬼针草属植物在全世界大致有230～240种，分布在热带以及温带地区，其中分布种类最丰富的地区是美洲[1-3]。该属植物中国各地均有分布，在路边和农田中常见，是民间常用草药[4-6]。

2015—2017年，我们在青岛、临沂、济南分别采到一种鬼针草属植物，此植物特别高大，在叶形等方面与鬼针草属其他种有明显区别。结合相关文献，本文对原植物在植物形态、显微鉴别、分子鉴别等方面进行了研究。

1 材料与仪器

1.1 材料

原植物经山东中医药大学生药教研室徐凌川教授鉴定并定名为高大鬼针草(BidensproceraL.C.Xu ex X.W.Zheng)，凭证标本均保存于山东中医药大学药学院标本室(SDCM)。

1.2 仪器

YXJ-2离心机(常州国华电器有限公司)；SW-CJ-1D洁净工作台(上海鼎科科学仪器有限公司)；DK-8D型电热恒温水槽(上海一恒科学仪器有限公司)；光学显微镜(德国Bresser公司)；IB-5型离子溅射仪(日本EIKO公司)；PCR反应扩增仪(天津金思德生物技术有限公司)；SUPRATM55 热场扫描电子显微镜(德国蔡司公司) ；水合氯醛、浓盐酸、间苯三酚等试剂均为分析纯；娃哈哈纯净水

2 方法

2.1 形态鉴别

对植物的外观形态进行观察，对其形态特征进行描述。

2.2 显微鉴别

制作茎的临时切片时，采用徒手切片法切片，后加间苯三酚试液1～2滴，稍放置，再加浓盐酸1滴染色，在显微镜下观察。

制作叶下表皮的临时装片，采用叶表皮制片法做叶下表皮的水装片，显微镜下观察其显微特征。

制作粉末的临时装片时，采用粉末制片法制作茎、花、叶的粉末透化片，观察组织构造与粉末特征并绘图[7]。

将高大鬼针草的花粉均匀放置在粘有双面导电胶的扫描电镜标本台上，经IB-5型离子溅射仪喷金后，在热场发射扫描电子显微镜下观察花粉粒形态，并对花粉粒进行拍照。花粉粒形状由极轴与赤道轴的比值决定，P/E的值在0.88～1.14之间为近球形，花粉粒大小由极轴与赤道轴(P×E)来决定[8]，刺状突起的密度按100 μm2的刺状突起个数表示。

2.3 分子鉴别

通过试剂盒法提取高大鬼针草的基因组DNA，经PCR反应程序，将PCR反应产物纯化后，对核糖体DNA ITS区域的碱基序列进行测定，记录高大鬼针草DNA的ITS碱基序列。

3 结果

3.1 原植物形态

一年生草本植物，高70～220 cm。茎直立，表面绿色，为四棱形，稍扁，有纵条纹，有稀疏短毛或无毛，四周向内凹陷，断面深绿色，中间髓为白色。叶草质，叶脉为羽状网脉，叶上表面有稀疏的白色短毛，叶下表面有密集的白色柔毛，较上表面长且多，叶柄长，背面微凸，正面有沟，沟内及边缘有稀疏的白色柔毛，叶柄基部有白色柔毛，叶味苦、有清香；上部叶二回或一回羽状分裂，互生或对生，中部叶最大，二至四回羽状分裂，对生，顶生裂片为条状披针形，无或具1～3个不规则粗齿，下部叶二至三回羽状分裂，对生，顶生裂片为三角状或菱状披针形，边缘有不规整的粗齿。头状花序单生茎端和枝端，连同总苞苞片直径4～5 mm，高约4～7 mm。舌状花黄色，有2～4枚；总苞钟状或杯形，外层苞片7～9枚，通常为8枚，倒卵状披针形，叶状，草质，被柔毛，边缘有缘毛，内层苞片通常10枚，披针形，膜质，长6～7 mm，具淡黄色边缘，无舌状花，筒状花两性，黄色，花冠长约5 mm，冠檐5裂；瘦果条形，具四棱，黑褐色，长约0.6～1.5 cm、宽约0.4～0.8 mm(不包括芒刺)，两端渐渐狭窄，表面有淡黄色短毛或者瘤状突起，顶端芒刺4枚，长约0.1～0.2 cm，具倒刺毛，果基圆形，淡黄褐色，向背面倾斜。花期为6～9月，果期为6～11月。

3.2 显微鉴别

3.2.1 茎横切面

呈方形，四角有明显棱脊。表皮细胞为一列细胞，沿切线延长。皮层窄，由5～7列薄壁细胞组成，排列较为疏松，有数列厚角组织。内皮层为一列细胞。韧皮部纤维束多呈半月形，断续排列。维管束为无限外韧型，大小不等，16～24个环列，其中一组对边维管束较另一组发达，韧皮部细胞狭窄，形成层成环，木质部断续呈环状排列，木质部导管2～6个并列径向排列。髓部较宽广，由薄壁细胞组成，约占茎部横切面的2/3。见图1。

1表皮；2皮层； 3厚角组织；4中柱鞘纤维； 5韧皮部；6形成层；7木质部； 8髓；9内皮层。图1 高大鬼针草茎的横切面图Fig.1 Transverse section of stem of Bidens procera L.C.Xu ex X.W.Zheng

3.2.2 叶下表皮

叶表皮细胞形状不规则，侧壁呈波纹状弯曲，互相镶嵌。气孔类型为不定式或不等式，副卫细胞约3～5个细胞。表皮细胞非腺毛多见，约4～12个细胞。见图2。

图2 高大鬼针草叶下表皮图Fig.2 The lower epidermis of the leaf of Bidens procera L.C.Xu ex X.W.Zheng

3.2.3 粉末

黄绿色。纤维众多。非腺毛为线状毛，单细胞或2～15个细胞组成。导管多见螺纹，少见梯纹、环纹导管。叶碎片表皮细胞形状不规则，侧壁呈波纹状弯曲、彼此互相镶嵌、大小不等，气孔类型为不定式或不等式。花粉粒圆球形，表面为刺状纹饰。草酸钙方晶少见。少见色素块。见图3。

1表皮细胞及气孔； 2非腺毛； 3冠毛；4导管；5纤维；6花粉粒；7花粉囊内壁细胞。图3 高大鬼针草粉末特征图Fig.3 Characteristic chart of powder of Bidens procera L.C.Xu ex X.W.Zheng

3.2.3 花粉粒的观察

花粉粒近球形，极轴25.61 μm(24.94～26.27 μm)，赤道轴20.73 μm(20.31～21.14 μm)，极赤比为1.24(1.21～1.26)；花粉粒大小是25.61 μm(24.94～26.27 μm)×20.73 μm(20.31～21.14 μm)；极面观为三裂圆形，赤道观为近圆形，萌发孔为三孔沟；外壁纹饰：刺状突起、刺渐尖、刺长4.72 μm(4.58～4.86 μm)、刺密度4.20(4.05～4.53)，基部膨大、有少量闭孔，基部宽4.21 μm(4.09～4.34 μm)，座间有大量疣状突起(括号外是各参数的均数，括号内是均数的95%置信区间)。见图4。

图4 高大鬼针草花粉粒的扫描电镜图Fig.4 SEM figure of Bidens procera L.C.Xu ex X.W.Zheng

3.3 DNA的ITS序列

本次实验测得原植物DNA的ITS序列为：

GGGGTGTCTTGATCTTGGCCTAGCTGATCGACTCGTGTACATGTACTTACACCTGGCTTT

GCGAGGACCAAAGCTCTTGTTTTGAGCCTCGTAAAGCCTTGTTGGCCTGCATTTAGGGCC

GCCCCTCGGGGTGTCCTGGATGTAGGTCGACACAACTAACAATTCGGCACAACACGTGCC

AAGGAAAACATTACTTAAAGGGCCCGTGCCATGTCGCCCCGTTTACGGCAAGCGCGTTGC

ACGTGGCCTCTTTGTAACCCTAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCACGCATCG

ATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGA

GTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCTTCTGGCTGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTC

ACGCATCACGTCGCCCCCACCATCCATCCCTTCTCGGGACATGTTGGTGTGGGGCGGAGA

TTGGTCTCCTGTGCCATGGCACGGTTGACCTAAATAGAAGTCCCCTCATGAGTGACGCAC

GACTAGTGGTGGTTGATAAGACTGTCGTATCGTGTCGTGCGTTCGTTTCATGCGGGCTTG

ACTCCTTGTAAAACCCACATGTGTTGTCCTGTGACGATGCTTCGATCGCGACCCCAGGTC

AGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAAAAACCGGAGGAAA

将本次实验结果在National Center for Biotechnology Information中的Gen Bank上经Blast后进行同源率分析，对比结果显示，与原植物的同源率最高的植物是婆婆针，同源率为89%，经山东中医药大学生药教研室徐凌川教授鉴定为鬼针草属植物高大鬼针草(BidensproceraL.C.Xu ex X.W.Zheng)。

4 小结与讨论

通过对原植物DNA的ITS碱基序列在NCBI中进行同源率分析鉴定后，结果显示与高大鬼针草同源率最高的植物是婆婆针。其与中国鬼针草属植物型态异同点见表1。

表1 中国鬼针草属植物叶、瘦果以及芒刺等特征的异同点Table 1 The similarities and differences of characteristics in leaves、achenes and prickles of Bidens L. from China

通过对高大鬼针草茎以及叶的形态、性状、显微特征进行系统的研究，发现高大鬼针草形态的鉴别要点是全株高70～220 cm。茎直立，表面绿色，为四棱形，有纵条纹。叶草质，叶脉为羽状网脉，叶柄长。头状花序，总苞钟状或杯形，舌状花黄色，筒状花两性；瘦果条形，具四棱，黑褐色，顶端芒刺四枚，具倒刺。显微特征的鉴别要点是：(1)茎横切面特征：茎表皮细胞为一列细胞；皮层窄，韧皮部纤维束多呈半月形，维管束为无限外韧型，韧皮部细胞狭窄，形成层成环，木质部断续呈环状排列；髓部宽广。(2)叶下表皮特征：叶表皮细胞形状不规则，侧壁呈波纹状弯曲；气孔类型为不定式或不等式；表皮细胞非腺毛多见。粉末特征：非腺毛为线状毛；导管多见螺纹，少见梯纹、环纹导管；花粉粒圆球形，表面为刺状纹饰，萌发孔为三孔沟。

本文的鉴定方法简便、易操作，得到了高大鬼针草重要的生药学鉴定特征，为高大鬼针草的生药学鉴定以及进一步的深入研究与利用提供了可靠的依据。

[1]中国科学院编辑委员会.中国植物志第七十五卷[M].北京:科学出版社,1979:369-381.

[2]杨美娟,杨德奎. 山东鬼针草属3种植物的花粉形态研究[J]. 山东科学,2007,20(1):42-44.

[3]BARTOLOME A P, VILLASEOR I M, YANG W C.BidenspilosaL. (Asteraceae): Botanical properties, traditional uses, phytochemistry, and pharmacology[J]. Evidence-based complementary and alternative medicine, 2013, 2013:340215.

[4]夏晓飞,胡丹丹,赵良成,等. 北京7种鬼针草属植物果实微形态特征及其系统学意义[J]. 西北植物学报,2011,31(10):2001-2007.

[5]李洪芹. 山东鬼针草质量研究[D].济南：山东中医药大学,2012.

[6]胡伟,陈飞虎,吴繁荣,等. 鬼针草药材的生药学鉴定[J]. 时珍国医国药,2009,20(2):329-330.

[7]陈向南,金晓艳,黄红雨,等. 双色金鸡菊的生药学研究[J]. 新疆中医药,2016,34(3):55-57.

[8]周洁,边丽华,邹琳,等. 不同品系忍冬花粉粒微形态特征比较[J]. 中华中医药杂志,2016,31(2):484-486.