Nrf2在肺纤维化治疗中作用的研究进展

陈 雁 王玉敏

(赤峰学院附属医院呼吸内科，内蒙 赤峰 024005)

肺纤维化(PF)是一种慢性、进展性、不可逆转的肺部疾病，临床表现为逐渐加重的呼吸困难，患者最终因肺功能严重受损发生呼吸衰竭而死亡。目前还没有方法可以完全阻断PF的发生。PF的发病机制仍未完全阐明，最近研究〔1〕显示氧化应激反应参与PF发病机制，因此，抑制氧化应激导致的肺损伤已成为防治PF的新策略。本文总结了肺部发生纤维化过程中氧化应激损伤的来源及其在PF形成中的作用，并对以转录因子(Nrf2)抗氧化通路为靶点治疗PF的进展进行了总结。

1 PF过程中氧化应激来源

氧化应激(oxidative stress)是指活性氧产生增多和/或抗氧化防御耗竭产生的一系列分子、细胞和组织的功能损害〔1〕。与机体其他器官相比，肺暴露于高水平的氧，使其更容易受到氧化应激的攻击从而产生损害，吸入的空气中氧的压力达到150 mmHg，而肺泡气氧的压力可达到100 mmHg。PF过程中氧化应激来源主要包括线粒体、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶和抗氧化防御体系酶的耗竭。

1.1线粒体介导产生活性氧(ROS) 线粒体产生ROS是介导PF产生的主要参与因素。线粒体功能障碍主要产生包括过氧化氢(H2O2)和超氧负离子(O2·-)在内的活性氧簇〔2〕。线粒体电子传递链(ETC) 是细胞内ROS产生的主要途径。ETC是O2·-的主要产生来源。大约2%的线粒体氧耗转变成O2·-。ETC是生物体三磷酸腺苷(ATP)能量的来源，在能量传递的过程中，一小部分电子发生泄漏，泄漏的电子被O2接收即生成O2·-。其中复合体Ⅰ和复合体Ⅳ产生ROS的能力较强。研究显示，肺泡巨噬细胞(AM)线粒体介导产生的H2O2在引起石棉沉滞症中的作用〔3〕，AM暴露于石棉样纤维(asbestos fibers)后可诱导H2O2的产生，而这一作用可被氧化氢酶(CAT)阻断，AM线粒体应激水平减弱。另外，Rho结合蛋白家族成员Rac1增加AM线粒体H2O2的产生，而敲低ETC复合体Ⅲ的ROS产生位点铁硫蛋白能够减弱石棉诱导的AM H2O2的产生。石棉沉滞症患者AM线粒体Rac1的表达水平升高，而条件性删除Rac1基因的小鼠肺内氧化应激水平较低和PF发生程度减轻。总之，石棉能够通过将电子由复合体Ⅲ转移给Rac1从而促进AM H2O2的产生，触发一系列下游事件，导致石棉沉滞症的发生。因此，推断Rac1可以作为PF的一个新的分子标志物。H2O2参与PF发生的另一项证据来源于CAT能够减弱石棉沉滞症啮齿类动物模型PF的发生〔4〕。另外，一些外源性毒素，如石棉样纤维能够激活参与PF发生的非内皮细胞线粒体ROS的产生〔5〕。

1.2NADPH氧化酶 NADPH氧化酶在肺内ROS的产生中发挥重要作用。NADPH氧化酶是一个与细胞膜结合的、含有多亚基的酶复合体，其主要功能是实现电子从NADPH跨细胞膜传递给分子氧，产生O2·-及其下游的ROS。NADPH氧化酶家族由NOX2，NOX1,NOX3,NOX4,NOX5,DUOX1和DUOX2 NADPH氧化酶7个成员组成，每个成员通过与细胞膜结合的催化亚基“Nox”或“Duox” 的不同进行区别。NADPH氧化酶催化亚基gp91phox/NOX2及其6个同源物统称为NOX家族蛋白。这些NOX家族蛋白在不同组织中具有独特的表达分布。当细胞受到刺激后4个细胞质成分募集到细胞膜上，与两个膜结合的成分组成有活性的NADPH氧化酶复合体，促进ROS的产生〔6〕。NADPH 氧化酶的主要功能是产生O2·和H2O2产生，从而参与细胞信号转导、杀死外来微生物的侵入等〔7〕。

最近研究显示NADPH氧化酶介导产生的ROS在PF过程中发挥重要作用，尤其是NOX1,NOX2,NOX4-NADPH氧化酶参与PF发病机制〔7〕。转化生长因子-(TGF)-β诱导激活NOX4-NADPH 氧化酶，从而通过促进肌成纤维细胞分化和上皮再形成。TGF-β和氧化应激共同促进PF形成〔8〕。TGF-β是最强效促纤维化细胞因子，通过调控细胞的增殖、分化、黏附、迁移、凋亡及上皮细胞间质转型(EMT)，进而在细胞外基质(ECM)沉积的过程中发挥重要作用。研究显示，NOX4-NADPH氧化酶介导产生的H2O2对于TGF-β诱导的成纤维细胞分化和ECM产生是必须的，NOX4基因敲除或药理学途径抑制NOX4可以阻止博来霉素诱导的小鼠PF的发生〔9〕。同时博来霉素能够诱导小鼠肺内NOX4的表达升高，PF患者肺内NOX4的表达也是升高的〔9〕。TGF-β1诱导的成纤维细胞分化与细胞外H2O2的产生相关，后者促进肺泡上皮细胞(AEC)死亡。AEC死亡是PF的重要始动事件和PF持续存在的主要事件〔10〕。NOX4在PF患者增生的肺泡上皮中强效表达，尤其在2型肺泡细胞(AT2)中表达明显〔10〕。NOX4基因缺失，可阻止博来霉素诱导的小鼠AT2细胞凋亡的发生〔11〕。NOX-4化学性抑制剂处理来源于NOX4基因缺失的内皮细胞或AEC，能够降低TGF-β1介导的ROS产生和AEC凋亡。综上所述，NOX4-NADPH氧化酶介导产生的ROS参与AEC凋亡机制，进而促进PF发生。

NOX2-NADPH氧化酶同时也参与PF的发生。最近研究发现，NOX2基因缺失的小鼠，能够阻止博来霉素诱导的小鼠PF的发生〔7〕。

1.3抗氧化防御体系酶的耗竭 肺本身表达一些抗氧化酶，从而保护肺脏因氧化应激引起损伤。抗氧化防御体系的酶的缺失能够促进氧化应激的发生，进而促进PF的发生。

1.3.1CAT CAT可促使H2O2分解为分子氧和水(2 H2O2→2 H2O+O2)，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。CAT 是AEC和炎症细胞内H2O2的清除剂，能够抑制H2O2介导的PF患者肺内成纤维细胞的活化〔12〕。持续静脉滴注聚乙二醇-过氧化氢酶能够阻止大鼠石棉沉滞症诱导的PF发生。

1.3.2谷胱甘肽(GSH) GSH是正常肺内的小分子抗氧化剂，PF患者肺内GSH含量减低。谷胱甘肽前体N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以增加PF动物模型肺内的GSH水平，减弱博来霉素诱导的PF的发生。雾化吸入NAC，能够增强PF患者抗氧化/氧化平衡体系。一项3期临床实验表明，NAC显示出对PF的潜在治疗价值〔11〕。

2 Nrf2与PF的治疗

2.1Nrf2与PF 机体细胞本身具有一套复杂的抗氧化系统，此系统组成Nrf2-抗氧化反应元件(ARE)-抗氧化酶通路。生理状态下，在胞质内的Nrf2与细胞骨架相关性抑制蛋白(Keap1)结合形成一个复合体，使Nrf2经泛素蛋白酶途径降解。当细胞或机体暴露于ROS时，引起Keap1的修饰，从而使Keap1募集Nrf2的功能发生改变，Keap1-Nrf2复合体解离，Nrf2从胞质转位到细胞核，与受其调控的抗氧化酶基因的ARE结合，从而启动编码解毒和抗氧化的基因表达，使其表达上调，促进细胞存活等功能。见图1。

图1 Nrf2抗氧化系统

Nrf2在调节PF过程中的作用引起研究者的关注。Cho等〔11〕是最早研究Nrf2在PF中的作用，研究显示，Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)的小鼠中，博来霉素诱导小鼠肺损伤和内皮细胞死亡较野生型小鼠(Nrf2+/+)加重。而反应PF化的指数，即羟脯氨酸含量、胶原沉积、纤维化评分，细胞增殖程度，Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)的小鼠较野生型小鼠(Nrf2+/+)水平高。博来霉素诱导野生型小鼠(Nrf2+/+)Nrf2的表达和活性升高。博来霉素可以在野生型小鼠(Nrf2+/+)上调一些受Nrf2调控的细胞保护蛋白的表达。同时，与Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)的小鼠比较，在野生型小鼠(Nrf2+/+)博来霉素诱导的反应肺损伤和PF的标志物的蛋白水平较低。综上研究表明，Nrf2在PF的发生发展过程中起到抑制PF发生的保护作用，这一保护作用通过上调特定细胞保护蛋白实现。因此，Nrf2成为治疗PF的新的潜在靶点。最近的一些研究，进一步证实了这一推断，在Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)的小鼠中对博来霉素和百草枯(paraquat，PQ)诱导的PF发生更加敏感〔13〕。博来霉素可以通过调控ERK1/2进而抑制Nrf2活性，从而促进氧化应激的产生和PF的发生〔14〕。

2.2激活Nrf2在PF中的保护作用 激活Nrf2抗氧化通路在PF中具有保护作用，使其成为治疗PF的新靶点。以Nrf2抗氧化通路为靶点治疗PF方面，研究者做了有益的探索，取得了一些进展。

2.2.1抑制博来霉素诱导的PF发生 Sriram等〔15〕较早提供了调控Nrf2在PF中具有保护作用的研究证据，研究显示，表没食子儿茶素(EGCG) 可以抑制博来霉素诱导的PF发生，博来霉素可诱导大鼠肺内ROS产生、脂质过氧化作用、羟脯氨酸和髓过氧化物酶的活性增加，EGCG可以减弱这一作用，并恢复博来霉素引起的抗氧化状态。免疫组化分析发现，博来霉素可导致大鼠肺炎症反应增加和肺泡损伤，而EGCG可以降低博来霉素引起的胶原沉积。进一步分析发现，EGCG能够上调博来霉素引起的细胞保护酶基因的表达降低，即上调谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和依赖还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶 1(NQO1)的表达。同时研究显示EGCG是Nrf2的激活剂。综上所述，EGCG通过激活Nrf2，进而促进GST和NQO1的表达来抑制博来霉素引起的PF发生。植物源性多酚类黄酮类抗氧化剂槲皮素能够通过激活Nrf2，进而上调血红素加氧酶(HO)-1的表达来抑制TGF-β诱导的胶原蛋白的产生，进而抑制PF的发生〔16〕。在雄性Wistar大鼠，黄连素能够抑制博来霉素引起的肥大细胞沉积和组胺的释放，并通过激活Nrf2来增加肺内抗氧化状态，抑制核转录因子(NF)-κB依赖的TGF-β通路激活，进而抑制PF的发生〔17〕。另外最近的研究显示，葫芦巴种子提取物苷〔18〕、丹酚酸〔19〕、南蛇藤醇〔20〕、利拉利汀〔21〕、 中华猕猴桃果仁非饱和脂肪酸〔22〕、苦参碱〔23〕、萝卜硫素〔24〕、广谱抗纤维化作用药物吡非尼酮(PFD)〔25〕均能够不同程度激活Nrf2通路，上调细胞保护蛋白的表达，抑制氧化应激的发生，进而抑制博来霉素引起的PF发生。

2.2.2抑制百草枯诱导的PF发生 诺奥奶蓟草提取物复合胶囊能够在SD大鼠和A549细胞中通过激活Nrf2，进而促进HO-1和NQO1的表达，减弱炎症和氧化应激发生，从而抑制PQ引起的PF发生〔26〕。研究显示葛根素可以抑制PQ诱导的小鼠PF的发生，进一步研究表明，葛根素能够通过激活Nrf2，进而阻断Fstl 1通路、TGF-β1通路和氧化应激发生进而抑制PF的发生〔27〕。最近研究表明，丹酚酸B能够同过激活Nrf2，降低NOX4-NADPH 氧化酶水平，从而减弱PQ引起的小鼠肺内氧化应激的发生，并抑制TGF-β1的表达及其下游蛋白Smad3的磷酸化，最终抑制PQ引起的小鼠PF发生〔28〕。雷怕霉素同样也能够通过激活Nrf2通路抑制PQ引起的PF发生〔29〕。治疗疟疾急性发作的氯喹同样也可经过Nrf2通路的激活，上调HO-1和NQO1的表达，抑制氧化应激的发生，从而能抑制PQ引起的PF发生〔30〕。综上所述，激活Nrf2通路了，能够抑制百草枯诱导的PF发生。

2.2.3抑制硅诱导的PF发生 硅肺病是世界范围内最常见的职业性肺疾病。二氧化硅(SiO2)能够通过诱导大鼠肺内ROS和丙二醛(MDA)产生增加，激活Nrf2及其下游硫氧还蛋白(Trx)。硅抑制Trx活性并下调硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的表达，表明硅抑制Trx系统。所以硅通过抑制Trx系统，诱导氧化应激发生，进而诱导大鼠肺PF的发生〔31〕。

最近研究显示，蚯蚓提取物能够通过激活Nrf2依赖的机制抑制二氧化硅诱导的小鼠肺PF的发生〔32〕。蚯蚓提取物可以抑制二氧化硅引起的氧化应激、线粒体依赖的凋亡发生和上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)。因此，蚯蚓提取物是潜在的通过激活Nrf2而在PF治疗具有前景的药物。

2.2.4抑制烟气诱导的PF发生 最近研究显示，硫化氢(H2S)能够通过激活Nrf2，进而上调HO-1和硫氧还蛋白(Trx)-1的表达来抑制慢性烟气暴露氧化应激的发生和炎症的产生，进而抑制大鼠肺PF的发生〔33〕。H2S能够减少慢性烟气暴露大鼠肺内氧化应激水平，减少超敏C反应蛋白、TNF-α、IL-1β和IL-6。

3 问题与展望

目前研究表明，Nrf2在抑制肺纤维化过程中具有保护作用，但Nrf2依赖的下游效应因子与PF之间的相互作用仍阐释不清。Nrf2及受其调控蛋白在PF中作用的进一步阐明,对以Nrf2为靶点筛选治疗PF的药物至关重要，对于PF的预防和治疗具有深远意义。

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