群体感应系统及其在乳酸菌生物膜形成中的作用

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(哈尔滨工业大学化工与化学学院,黑龙江哈尔滨 150090)

群体感应(quorum sensing,QS)是细菌进行种间或种内信息交流的一种信号转导机制,通过释放、感知和响应小分子信号物质来调控细菌的一系列的生理生化功能[1],包括毒力因子的产生[2]、抗生素及色素的产生[3]、细菌素的产生[4]和生物膜的形成[5]等。群体感应现象的发现最早源于Engebrecht等人对海洋发光细菌Vibrio fischeri的光致发光这一生理现象的研究[6]。相关研究发现,细菌会向胞外分泌一种自诱导物作为感知周围环境中种群密度大小的信号分子,进而调控相应的基因表达,以对细菌的生理生化行为进行调节,这种基于群体密度感知的行为调节模式是在细菌QS系统的调控下完成的。

乳酸菌是一种革兰氏阳性菌,其作为一种益生菌,具有产酸耐酸[7]、抑制致病微生物生长繁殖[8]、调节肠道微生物群[9]以及增强人体免疫力[10]等多种有益的生理活性功能,因而其在食品加工贮藏和营养保健方面得到广泛的关注和应用。自然界中,绝大多数细菌都可以形成生物膜,群体感应调节机制也在不同细菌物种中普遍存在,乳酸菌也不例外。成熟的生物膜可以帮助乳酸菌抵御不利的外界环境,有助于提高菌体酸性耐受力、维持自身生长和发挥益生作用等[11]。目前,对于不同种细菌的生物膜形成过程及其与QS系统之间关系的研究有很多,但大部分集中在如何控制致病菌生物膜的形成等。本文以QS系统为出发点,对QS系统调控乳酸菌生物膜的形成机制进行阐述,对于高效发挥益生菌的益生作用具有重大意义。

1 乳酸菌QS系统组成及调节机制

细菌的QS系统按照信号分子种类的不同而分为不同的类型。在革兰氏阴性菌的QS系统中,普遍以一种酰化高丝氨酸内酯作为信号分子去感知菌群密度,最终达到对细菌行为方式进行调节的目的[12]。乳酸菌作为革兰氏阳性菌,拥有一套不同于革兰氏阴性菌的QS系统,其QS系统以一种自诱导信号(antoinduction,AI)感知胞间讯息,此外还包括一个用于感应自诱导信号的双组分信号转导系统(two-component system,TCS)。

1.1乳酸菌QS系统信号分子

乳酸菌的信息交流模式以细胞密度依赖性方式进行,大体分为种内信息交流和种间信息交流两种。

种内信息交流以一种特异性自体诱导物1(antoinduction-1,AI-1)小分子信号肽(autoinducing signalling peptides,AIPs)作为信号分子,这些AIPs的产生通常经过翻译后修饰:首先,具有保守残基的可识别前导肽对细胞质中的寡肽类物质进行切割;随后将其加工成可分泌到胞外的成熟AIPs;最后,通过专用运输系统ATP结合盒转运体转运输出[13]。不同菌体及不同的QS系统的AIPs具有一定的差异,这种特异性主要是由氨基酸排列顺序的不同以及空间结构的差异决定的[14]。

种间信号交流是不同种细菌的细胞间信号通讯方式,以不同于种内信号交流的另一种自体诱导物2(antoinduction-2,AI-2)呋喃酮酰硼酸二酯作为信号分子,现已报道在革兰氏阴性菌和阳性菌中都存在以AI-2感知环境竞争压力的AI-2/LuxS QS系统调节机制[15],这个QS系统在多种细菌种内和种间的信息交流中都发挥着重要作用[16-17]。在AI-2/LuxS QS系统中,由luxS基因介导AI-2的信号传导,luxS基因是一种高保守性基因,在革兰氏阴性菌和阳性菌中都广泛存在,现已证明参与群体感应的luxS基因控制乳酸菌的不同行为[18-19]。AI-2是由甲硫氨酸作为起始物,经过四个酶促反应步骤产生的:首先,甲硫氨酸在甲硫氨酸合成酶的催化作用下产生S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM);然后,SAM作为甲基供体在SAM依赖性甲基转移酶作用下生成S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH);接下来,SAH被SAH核苷酸酶催化分解成腺嘌呤和S-核糖同型半胱氨酸(S-ribosylhomocysteine,SRH);最后,SRH在LuxS蛋白的催化下生成同型半胱氨酸和4,5-二羟基-2,3-戊二酮,前者进一步生成甲硫氨酸,AI-2则作为副产物由后者衍生而来。4,5-二羟基-2,3-戊二酮自发重排使得AI-2分子具有特异性[20]。在整个过程中,LuxS蛋白作为催化AI-2合成的关键酶,由luxS基因表达得到,如果细菌的LuxS蛋白失活或luxS基因未表达,则无法产生AI-2进行细胞间信号传递。Buck等人通过位点特异性整合,在嗜酸乳酸杆菌的luxS基因位点处中产生同基因突变,所得的luxS突变体不产生AI-2,证明了luxS基因在AI-2的产生中起到重要作用[21]。

1.2乳酸菌群体感应中的双组分信号转导系统(QS-TCS)

微生物具有感测环境信号和响应环境变化的能力,TCS是监测和转导环境信号最重要的机制之一,这一系统作为乳酸菌QS系统的重要组成部分,在对群体感应信号分子的转导方面发挥着重要作用。QS-TCS的主要作用是对输出到胞外的QS系统的信号分子进行感知进而达到调控菌体行为的目的[22]。一个典型的TCS由检测特定环境信号的膜相关组氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase,HPK)和细胞质应答调节子(response regulator,RR)组成。HPK通常由一个可变的N端信号输入结构域和一个保守的C端自激酶结构域两部分组成,自激酶结构域又可以分为两个亚结构域:组氨酸磷酸转移酶亚结构域和ATP结合亚结构域。 RR通常由调节结构域和DNA结合结构域两部分组成,其中调节结构域位于N端,含有一个可接受的磷酸基团的天冬氨酸残基,作为信号接收位点;DNA结合结构域位于C端,作为信号输出位点。在TCS中,信号分子的信息传递过程如下:通过组氨酸蛋白激酶的输入结构域检测到信号分子,使其自身被激活。具有活性的组氨酸蛋白激酶通过ATP水解在组氨酸残基上发生自磷酸化,然后将该磷酰基转移至RR的受体结构域中的天冬氨酸残基,进而激活调节蛋白并促进转录反应[23]。大量研究通过基因敲除构建的QS-TCS突变型菌株与野生型菌株相比,出现耐酸性下降[23]、自溶率升高[24]等表现,证明了TCS在微生物适应环境中的重要作用。

2 乳酸菌生物膜形成机制

生物膜是是细菌粘附于惰性物体或活体生物表面生长、繁殖,由其自身分泌的胞外多聚基质所包被起来形成的一种具有高度组织化的微菌落聚集体[25],是菌体为抵御不良环境而发展形成的一种自我保护模式。在自然界中,除了极少部分细菌以浮游形式存在外,绝大多数细菌都是以生物膜形式存在的[26]。乳酸菌作为益生菌,促进健康和发挥最佳功能的关键因素就在于它的存活能力和生物膜的形成可以提高乳酸菌的耐酸、耐渗透压等能力,提高抗菌活性[27-28]，同时,也会大大提高乳酸菌作为食品添加剂掺入食品,或是作为益生菌提高在机体肠道存活率。

2.1乳酸菌生物膜的组成

成熟的生物膜中包含多种成分,其中主要是有机基质和细菌生命体。有机基质是外膜蛋白质以及一些分泌到胞外的多糖和核酸等,这些胞外多聚基质参与细菌的粘附,它们相互连结成细胞间质,包裹在细菌微菌落外部或存在于细菌单细胞之间,为细菌提供了天然的“屏障”,以减少外界不良环境对菌体的侵害[29]。另外,有机基质除了提供菌体粘附性之外,还可以赋予生物膜表面疏水性功能[30]。生物膜内的细菌生命体与浮游细菌在形态和生理特性等方面具有明显的差异,生物膜表层的细菌与内部的细菌也具有一定的差异。位于生物膜表层的细菌更容易接触和利用到环境中的营养成分,因此分裂速度快,代谢也比较活跃,菌体的体积相对较大,与浮游细菌类似。而处在生物膜内部的细菌,其获得营养物质的传送及排泄物的运输途径只能是通过由有机基质粘连形成的间质间水通道进行,因此代谢物排出缓慢,代谢率较低,菌体多处于不活跃的休眠状态[31]。

2.2乳酸菌生物膜的形成过程

乳酸菌生物膜的形成与大多数细菌一样,是一个动态循环的过程。在这个过程中要经历以下几个阶段:首先,菌体通过鞭毛运动粘附于物体表面,此时细胞的粘附强烈依赖于细菌细胞表面的理化性质,微生物尚未发生形态变化,生物膜还未形成,粘附的细菌还可以成为浮游状态,因此粘附是可逆的;当粘附的细菌逐渐增多,细菌与物体表面的可逆弱结合转变成具有胞外粘性基质的永久性不可逆结合;随着物体表面的细菌的大量聚集,分泌到胞外的基质也越来越多,细菌相互粘附,牢固地贴于物体表面,逐渐形成大量微菌落这时的粘附是不可逆的;之后,生物膜渐渐成熟并且发展成由蘑菇状或株状微菌落不断堆积形成的有组织的、不均匀的结构;在生物膜成熟后,生物膜中的细菌通过部分脱落或释放等方式游离出来,寻找新的位点,开启新一轮生物膜的形成之路[11],这一过程称为生物膜的释放。简单地讲,生物膜的形成主要就是由多糖细胞间粘附素、蛋白质和核酸等胞外粘性基质介导的细菌的粘附和多层细菌的积累[32]。在细菌的粘附积累过程中,QS系统发挥着相当的作用[29]。

3 QS系统介导乳酸菌生物膜形成

乳酸菌生物膜的形成源于菌体在物体表面逐渐由可逆粘附转变成为不可逆的结合与积累,其通过群体感应和菌体细胞间的相互作用来控制,形成生物膜的细菌通过生物膜直接进行接触,这部分菌体与具有的生理活性与浮游状态的细菌相比已发生了改变[33]。相比于浮游细菌,生物膜表层细菌会分泌更多的有机基质到胞外,以提高菌体的粘附性,进一步提高菌体定植于物体表面形成生物膜的能力。

3.1QS系统与细菌粘附性的关系

生物膜形成的关键在于细胞粘附性的提高,其在一定程度上有助于菌体的积累,进而促进生物膜的形成与成熟。有关生物膜的形成能力与细胞粘附性之间的关系在一些研究中得到证明。有研究表明在没有葡萄糖的MRS培养基中添加粘蛋白使鼠李糖乳杆菌的生物膜形成能力提高了20%[34];植物乳杆菌和发酵乳杆菌在高浓度胆汁和粘液下形成生物膜[35];Lebeer 等人获得的含胞外多糖合成相关基因的鼠李糖乳杆菌突变株与野生型相比,其生物膜形成能力也得到了提高[36]。有关QS系统的信号分子能够影响乳酸菌的粘附性已有相关报道,Buck等研究发现,嗜酸乳杆菌luxS 基因缺失突变株相比于野生型菌株,其粘附于肠表皮细胞的能力下降了58%,而luxS基因是AI-2分子合成的关键酶基因[21]。Sturme等人则在植物乳杆菌WCFS1中发现了与金黄色葡萄球菌中调控生物膜形成有关的QS系统——agrBDCA系统具有同源性的lamBDCA系统[37]。有关agrBDCA系统调节生物膜形成的过程大致如下:AgrD作为前体产生具有独特的硫酯环结构的八肽型AIPs,并通过AgrB膜蛋白运输到胞外,随着细胞密度的增加,AIP的浓度逐渐提高,与组氨酸激酶受体AgrC结合,使之磷酸化,激活响应调节剂AgrA,被激活的AgrA与全局调节子SarA协同作用,导致细胞内的RNAII(与QS扩增有关)和RNAIII(与外蛋白产生有关)的转录[33]。在植物乳杆菌WCFS1的lamBDCA系统中,LamD作为自诱导肽前体由LamB加工蛋白加工成LamD-衍生肽,这两种蛋白均由lamBD基因表达而来。LamD-衍生肽是与agr系统的AIP结构类似的一种环状硫内酯五肽,命名为LamD558。实验发现lam系统参与了植物乳杆菌玻璃表面粘附的调节,说明乳杆菌中agr样QS系统——lamBDCA系统在提高细胞粘附方面有着不可忽视的作用,这能够为QS系统介导乳酸菌生物膜的形成提供一定证据。

3.2QS系统与生物膜形成的关系

QS系统能够介导乳酸菌生物膜的形成来自Lebeer等人的研究,他们发现鼠李糖乳杆菌luxS基因缺失突变株形成生物膜的能力下降,外源添加AI-2前体分子或野生型菌株则可以部分回补突变株生物膜的形成,但不能恢复到原始状态[38]。乳酸菌QS系统的信号分子自诱导肽在菌体生长期间以低水平产生,当细胞密度达到一定阈值时,与TCS中受体激酶HPK结合,使之发生自磷酸化,随后磷酸基团的转移激活响应调节剂RR,引起动态范围内的自身诱导[39]。QS系统介导乳酸菌生物膜的形成主要在膜的生长期和散播期发挥作用[29]:生长期即指细菌的不可逆粘附与积累时期,这一阶段的特点是由于胞外粘性基质的分泌,乳酸菌体大量粘附聚集,信号分子感知细胞密度,达到阈值后引起细胞内特定RNA转录,促进生物膜的成熟。散播期则是在生物膜成熟之后,这一阶段由于生物膜内部细菌的代谢废物只能通过间质水通道排除,大量粘附聚集的细菌导致有限的空间内代谢废物的累积,出现种内或种间竞争。在这一过程中,细胞QS系统在不利的环境因素下通过启动特定基因表达,调控生物膜内细菌部分脱落,重新成为浮游状态,避免细菌过度生长,出现代谢废物累积、营养物质匮乏等不良情况[40]。

4 结语和展望

乳酸菌在食品工业中,可作为食品添加剂用于酸奶制品生产、食品保藏等,由于乳酸菌生物膜可以提高乳酸菌在各种环境中的稳定性,将乳酸菌以生物膜形式添加到食品中还可以提高食品的稳定性。乳酸菌对人体的健康具有颇多的益处,如何提高乳酸菌在不利环境中的存活率,实现对菌体的高密度培养,一直是现阶段研究的热点问题。许多研究已经证实QS系统对乳酸菌包括生物膜形成在内的各种生理生化行为进行着调控,该系统对于生物膜的形成能力具有一定的影响,聚焦QS系统的调控机理、进一步研究QS系统是如何介导生物膜形成的分子机制对高效利用乳酸菌具有重大意义。

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