来源于Bacillus circulans的重组β-CGT酶的分离纯化及其生化性质分析

李才明 ， 黄 敏 ， 顾正彪 ， 洪 雁 ， 程 力 ， 李兆丰 *

（1．江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；3.江南大学 食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡214122）

环糊精（Cyclodextrin），又称 Schardinger糊精、环聚葡萄糖等，是由6个及以上D-吡喃葡萄糖通过α-1，4糖苷键连接而成的环状低聚物[1-3]。最常用的环糊精主要有3种，为α-、β-和γ-环糊精，分别由6、7和8个葡萄糖残基分子构成，这3种环糊精又统称为基础环糊精[4]。环糊精的空间结构呈中空圆筒形[5]，其外部含有葡萄糖单元C-2、C-3以及C-6的羟基，导致外部亲水；而其内腔含有醚键氧原子以及C-3和C-5上的氢原子，所以内腔疏水[6]。正因为这种特性，使得环糊精在食品、农业、生物、医药、化工等领域具有广泛的用途[7-9]。

环糊精的工业化生产均采用酶法工艺，即在环糊精葡萄糖基转移酶（EC2.4.1.19，Cyclodextrin glucanotransferase或Cyclodextringlycosyltransferase，简称CGT酶）的催化作用下通过环化反应转化淀粉或相关基质而生成环糊精[10-12]。根据CGT酶催化反应初始阶段所产生主要环糊精的种类，可将CGT酶分为3种类型，即α-CGT酶、β-CGT酶、γ-CGT酶[13]。

在前期研究中，来源于Bacillus circulans STB01的β-CGT酶成功在枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600中实现了胞外过量表达，为其工业化生产及应用打下了基础。为了促进重组β-CGT酶在工业上的应用，有必要全面分析其生化性质。虽然来源于B.circulans的β-CGT酶的一些生化性质已有报道[14-17]，但关于其不同pH下的热稳定性、酶浓度对其热稳定性的影响尚未见报道，而且有关金属离子对β-CGT酶环化活力影响的报道也不是很全面，尤为明显的是，大部分针对生化性质的研究主要是围绕CGT酶的水解活力进行开展，而非以其特征反应的环化活力为指标进行评价。研究报道显示，CGT酶催化水解反应和环化反应的最佳条件存在明显差异[18-19]，而环化反应是其工业应用的基础，因此，有必要以环化活力为评价指标对β-CGT酶的生化性质进行全面分析。

作者主要对重组β-CGT酶发酵上清液进行分离纯化，然后以环化活力为评价指标全面分析其生化性质。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 质粒和菌株 环状芽孢杆菌B.circulans STB01、E.coli JM109、宿主菌 B.subtilis WB600、质粒pST均保藏于本实验室。

1.1.2 主要试剂与材料 酵母粉和胰蛋白胨：购自英国 Oxoid 公司；α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、牛血清蛋白标准品：购自Sigma-Aldrich（上海）公司；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDSPAGE）和标准相对分子质量蛋白：购自碧云天生物技术研究所；卡那霉素、赤霉素：购自生工生物工程（上海）股份有限公司；疏水色谱填料Phenyl HP、强阴离子交换色谱填料Q-HP：购自美国Amersham公司；麦芽糊精（DE=5、15、25）：购自法国罗盖特公司；其它化学试剂均为国产或进口分析纯。

1.1.3 主要仪器 PTC-200型基因扩增仪：美国MJ Research公司产品；CR21GIII冷冻立式离心机：日本Hitachi公司产品；蛋白核酸定量测定仪：德国Eppendorf公司产品；GelDoc凝胶成像系统：美国Bio-Rad公司产品；905型超低温冰箱：美国Thermo scientific公司产品；Mini Protein 3蛋白电泳系统：美国Bio-Rad公司产品；DAMN HELEOS-II多角度激光光散射凝胶色谱系统 （配：Waters 1525 Binary HPLC泵、Wyatt Optilab T-rEX折光率检测器、Waters 2489紫外检测器、DAMN HELEOS-II Wyatt MALLS检测器）：美国Wyatt Technology公司产品；高效液相色谱 （HPLC）系统： 美国 Agilent Technolodies公司产品。

1.1.4 培养基 种子培养基为LB培养基，发酵培养基为TB培养基，固体平板培养基为添加质量分数1.5%琼脂的LB培养基；培养基的具体配制方法参照文献[20]进行。

1.2 实验方法

1.2.1 重组β-CGT酶的生产

1）种子培养 将-80℃冰箱中保藏的甘油管菌株接100 μL至装有50 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，接种量为体积分数0.1%，37℃摇床（200 r/min）培养过夜。接种前添加终质量浓度为5 μg/mL的卡那霉素和赤霉素。

2）发酵培养 将LB培养基中活化的枯草杆菌种子液以体积分数4%的接种量接入装有50 mL TB培养基的250 mL三角瓶中，37℃摇床 （200 r/min）振荡培养48 h，接种前添加终质量浓度为5 μg/mL的卡那霉素和10 μg/mL的赤霉素。

发酵培养结束后，将发酵液于4℃、10 000 r/min离心20 min，收集上清液即为重组β-CGT酶粗酶液。

1.2.2 重组β-CGT酶的纯化 β-CGT酶的纯化采用两步法：

第一步，疏水Phenyl HP柱（CV 50 mL）。缓冲液 A1为含 1 mol/L （NH4）2SO4的磷酸缓冲液（10mmol/L，pH 6.5），缓冲液 B1为 10 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 6.5）；重组β-CGT酶粗酶液在10 mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）中透析48 h，一边搅拌一边缓慢加入 （NH4）2SO4固体至终浓度为1 mol/L，经0.45 μm微孔滤膜过滤；用5个柱体积的缓冲液A1平衡疏水Phenyl HP柱；上样，流速为10 mL/min；分别用（NH4）2SO4（0.8、0.6、0.4、0.2 mol/L）、缓冲液 B1、超纯水、0.5 mol/L NaOH进行梯度洗脱，流量为10 mL/min。

第二步，强阴离子交换Q-HP柱（CV 20 mL）。缓冲液A2为10 mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.5），缓冲液B2为缓冲液A2+1 mol/L NaCl；含有β-CGT酶的组分在缓冲液A2中透析48 h，上样，流量为5 mL/min；分别用 NaCl（0.1、0.2、0.3、0.5、1 mol/L），0.5 mol/L NaOH进行梯度洗脱，流量为5 mL/min。

β-CGT酶通过测定酶活和SDS-PAGE进行鉴定，纯化β-CGT酶超滤浓缩后分装，-80℃保存。

1.2.3 β-环化活力的测定 β-环化活力的测定采用酚酞法并作适当修改[21-22]，取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9 mL预先用10 mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）配制的 1 g/dL麦芽糊精（DE=5）溶液的试管中，在50℃下反应10 min后，加入3.5 mL 30 mmol/L NaOH和0.5 mL由5 mmol/L Na2CO3溶液配制的0.02 g/dL酚酞溶液停止反应，在室温下保温20 min，在550 nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成 1 μmol β-环糊精所需的酶量。

1.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳 SDS-PAGE电泳凝胶采用碧云天试剂盒制备，所用浓缩胶的质量浓度为5 g/dL，分离胶的质量浓度为10 g/dL，具体配方及操作参考产品说明书和相关文献[23-24]。电泳结束后，用质量分数0.1%考马斯亮蓝R-250对蛋白胶进行染色，并通过Quantity One软件估算酶蛋白的表观相对分子质量。

1.2.5 蛋白质浓度的测定 采用Bradford法[25]测定样品蛋白浓度，以牛血清蛋白（BSA）作为标准品，具体操作参见蛋白浓度检测试剂盒中的说明书。

1.2.6 β-CGT酶相对分子质量的测定 未变性β-CGT酶的相对分子质量采用多角度激光光散射凝胶色谱系统进行测定：HPLC柱型号：P8514-806Shodex Packed column；样品质量浓度1.7 mg/mL（溶于 10 mmol/L磷酸缓冲液，pH 6.5），以 BSA（相对分子质量为66 000）作为标准品；测试条件：进样量0.2 mL，流动相为10 mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.5，含质量分数0.02%NaN3，超声脱气处理），流量0.5mL/min，激光波长 658 nm，校正常数 2.5×10-5，数据采集时间间隔1 s；数据处理：采用系统自带软件ASTRA 5.3.4进行分析。

变性β-CGT酶的相对分子质量采用SDSPAGE方法估算。

1.2.7 β-CGT酶最适温度和热稳定性的测定 在不同温度（45～65℃）下，按1.2.3的方法测定纯化酶的β-环化活力，将酶活最高者定为100%，计算相对酶活，作温度-相对酶活力曲线，以确定酶的最适温度。

纯化酶（3.2×10-8mol/L）在不同温度（45、50、55、60℃）下保温，不同时间点取样，迅速冰浴冷却，按1.2.3的方法测定酶的残余酶活，以未保温的样品酶活力定为100%，计算相对残余酶活，作时间-相对酶活力曲线。

1.2.8 β-CGT酶最适pH和pH稳定性的测定 分别用浓度为10 mmol/L的不同pH值的缓冲液 （柠檬酸-柠檬酸钠：pH 4～6；Na2HPO4-NaH2PO4：pH 6～8；甘氨酸-氢氧化钠：pH 8～10）稀释酶液和配制底物，按1.2.3的方法测定纯化酶的β-环化活力，将酶活最高者定为100%，计算相对酶活，作pH-相对酶活力曲线，以确定酶的最适pH。

将纯化酶用上述不同pH缓冲液稀释至浓度约为 3.2×10-8mol/L，60 ℃下保温 30 min，不同时间点（10、20、30 min）取样，迅速冰浴冷却，按 1.2.3 的方法测定酶的残余酶活，以未保温的样品酶活力定为100%，计算相对残余酶活，作时间-相对酶活力曲线。

1.2.9 金属离子对β-环化活力的影响 在麦芽糊精 （DE=5）底物中添加一定终浓度的金属离子，按1.2.3的方法测定纯化酶的β-环化活力，以未添加金属离子的酶活性定为100%。

1.2.10 β-CGT酶产物特异性分析 用10 mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）配制5 g/dL的麦芽糊精（DE=5）溶液作为底物，加入终浓度为1 U/mL的纯化酶，置于40℃摇床（200 r/min）中反应12 h，不同时间点取样，煮沸灭酶 10 min，加入10 μL糖化酶（100U/mL）糖化 30 min，煮沸灭酶 10 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液，经0.45 μm超滤膜过滤后，采用高效液相色谱法（HPLC）测定反应液中α-、β-和γ-环糊精浓度。

HPLC测定条件为：Agilent 1260 HPLC系统（配示差折光检测器），色谱柱Lichrosorb NH2（4.6 mm×150 mm），流动相采用体积分数68%的乙腈水溶液，柱温为30℃，流量为1 mL/min。

1.2.11 β-CGT酶动力学参数的测定 用10 mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）分别配制底物浓度为0.1～10 mg/mL的溶液，按1.2.3的方法测定β-CGT酶的酶活，按Lineweaver-Burk双倒数法作图，计算酶的动力学参数，包括：米氏常数 （Km）、最大反应速率（Vmax）、催化常数（Kcat）和催化效率（Kcat/Km）。

1.2.12 数据处理 实验结果为3次平行实验的平均值，用平均值和标准偏差表示。采用OriginPro 8.0软件（美国OriginLab公司）分析数据和作图；显著性分析（P＜0.05）采用SPSS软件进行，通过单因素方差分析（ANOVA）、Student-Newman-Keuls（SNK）程序来实现。

2 结果与讨论

2.1 酶的分离纯化

2.1.1 Phenyl HP柱疏水层析 从图1（a）可以看出，目的蛋白主要集中在 0.2 mol/L （NH4）2SO4（条带F）洗脱液中，其次在 0.4 mol/L（NH4）2SO4（条带 E）洗脱液中也有一定含量，同时酶活验证也进一步证实了这一点。合并条带E、F对应的洗脱液，在10mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）中透析48 h，进行下一步阴离子交换层析，以进一步纯化目的蛋白。

β-CGT酶的理论相对分子质量为77 300，重组β-CGT酶粗酶液在还原与非还原状态下的SDSPAGE分析如图1（B）所示，从图中可以看出，β-CGT酶蛋白在粗酶液中占主要成分，而且分子间不存在二硫键。重组β-CGT酶的纯化采用Phenyl HP柱疏水层析和Q-HP柱阴离子交换层析相结合进行。

2.1.2 Q-HP柱阴离子交换层析 从图2（a）可以看出，经Q-HP柱阴离子交换层析后，目的蛋白几乎都集中在透过液中（条带B），且已达到电泳纯。收集条带B对应的酶溶液，进一步超滤浓缩保存。从图2（b）可以看出，重组β-CGT纯酶在还原与非还原状态下的表观相对分子质量基本相同，约为76 500，与理论相对分子质量77 300接近，说明分子间不存在二硫键，而且酶蛋白分子在溶液中以单聚体形式存在。

重组β-CGT酶粗酶液的纯化结果如表1所示，通过测定相应纯化步骤中的酶活性及蛋白浓度，最终β-CGT酶的比酶活为296.5 U/mg，纯化倍数达到27.2，回收率高达45.3%。

图1 重组β-CGT酶粗酶液和Phenyl HP柱纯化过程的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the crude recombinant β-CGTase and the purification process of Phenyl HP column

图2 Q-HP柱纯化过程和纯化酶液的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purification process of Q-HP column and the purified enzyme

表1 β-CGT酶的分离纯化Table 1 A summary of the purification steps of β-CGTase

2.2 酶相对分子质量的测定

采用多角度激光光散射凝胶色谱系统进一步测定β-CGT酶蛋白的相对分子质量，结果如图3所示，经系统自带软件ASTRA 5.3.4分析，该酶分子平均相对分子质量为76 600，与SDS-PAGE分析结果相当，接近其理论相对分子质量。多分散性系数Mw/Mn为1.001，说明相对分子质量呈单分散，也进一步验证了酶蛋白分子在溶液中是以单聚体形式存在。

图3 多角度激光光散射凝胶色谱图Fig.3 Multi-angle laser light scattering gel chromatogram

2.3 酶浓度对其热稳定的影响

酶浓度在其热稳定性研究中是首先需要考察的一个因素，作者采用10 mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）将浓缩纯β-CGT酶稀释至4个不同浓度，分别为 2.0×10-6、5.1×10-7、1.3×10-7和 3.2×10-8mol/L，分别研究其60℃下的热稳定性，结果如图4所示，β-CGT酶浓度越高，其热稳定性越好，说明低的酶浓度能够降低非共价分子间的相互作用。在后续酶热稳定性的研究中，酶浓度选择3.2×10-8mol/L。

图4 β-CGT酶浓度对其热稳定性的影响Fig.4 Effectofthe enzyme concentration on the thermostability of β-CGTase

2.4 最适温度和热稳定性

在不同温度（45～65℃）下进行酶活力测定，将酶活最高者定为100%，结果如图5（a）所示，β-CGT酶环化反应的最适温度为60℃。

图5 温度对β-CGT酶活性和热稳定性的影响Fig.5 Effectsoftemperatureon the activity and thermostability of β-CGTase

β-CGT酶在 45、50、55和 60℃下的稳定性结果如图 5（b）所示，45、50、55 和 60 ℃时的半衰期分别为 6.8、4.5 h、55.6 min 和 6.5 min，60 ℃保温 20 min导致酶基本失去活力，说明该酶的热稳定性较差。

2.5 最适pH和pH稳定性

在不同pH（4～10）条件下进行酶活力测定，将酶活最高者定为100%，结果如图6所示，β-CGT酶在pH 5～7的范围内，酶活力较高，其最适pH为6.5；pH低于5或高于7时，β-CGT酶的环化活力下降较快。在相同pH值时，β-CGT酶在甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的环化活力明显高于其在Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中的环化活力。

图6 pH对β-CGT酶活性的影响Fig.6 Effects of pH on the activity of β-CGTase

β-CGT酶在不同pH（4～10）条件下的热稳定性均较差，而且在pH值相同而类型不同的缓冲液中，其热稳定性也存在明显差异。在10 mmol/L pH 4～6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，β-CGT酶60℃保温10 min即几乎失去活力（数据未显示）。从图7（a）和表2可以看出，在10 mmol/L pH 6～8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，β-CGT酶60℃时的热稳定性随pH值的升高略有降低；从图7（b）和表2可以看出，在10 mmol/L pH 8～10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，β-CGT酶60℃时的热稳定性同样随pH值的升高而降低，pH 从 8.0 升高到 10.0 时，t1/2（min，60℃）降低了62.7%。很明显，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液更有利于β-CGT酶的稳定，暗示了甘氨酸可能能够提高β-CGT酶的热稳定性，但后续实验发现，β-CGT酶在含10 mmol/L甘氨酸的Na2HPO4-NaH2PO4（10 mmol/L，pH 6～8）缓冲液中，其热稳定性与未添加甘氨酸时几乎一致（数据未显示），说明甘氨酸只有在特定的缓冲液、特定的pH条件下才能有利于β-CGT酶的热稳定性。

图7 不同pH条件下β-CGT酶的热稳定性Fig.7 Thermostability of β-CGTase under different pHs

表2 不同pH条件下β-CGT酶60℃下的半衰期Table 2 Half-lives of β-CGTases at 60 ℃ under different pHs

2.6 金属离子对β-CGT酶环化活力的影响

金属离子通常能作为酶的辅因子而对其活力产生重要影响，为了验证β-CGT酶的环化活力是否对金属离子辅因子存有依赖，将一定终浓度的金属离子螯合剂（EDTA）加入到β-CGT酶反应体系中，并分析其对β-CGT酶环化活力的影响；同时研究了常规金属离子，包括：Li+、Na+、K+、Ca2+、Ba2+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Hg2+和 Fe3+， 对 β-CGT 酶环化活力的影响，结果如图8所示。EDTA和金属离子的终浓度分别为10 mmol/L和1 mmol/L，以未添加EDTA和金属离子条件下的环化活力为100%。每个值为3次平行实验的平均值，柱状图上不同字母表示显著性差异（P＜0.05）。

图8 EDTA和金属离子对β-CGT酶环化活力的影响Fig.8 Effects of EDTA and metal ions on the cyclization activity of β-CGTase

2.7 产物特异性

β-CGT酶催化底物能同时生成α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，从图9可以看出，在整个反应过程中，重组β-CGT酶的主要产物均为β-环糊精，其次为α-环糊精，γ-环糊精产量最低；尤其在反应的初始阶段，β-环糊精产量急剧增加，这正是定义来源于B.circulans STB01的CGT酶为β-型的根据；随着反应进行至3 h，3种产物的增加趋于平缓，α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精占总环糊精产物的比例分别为26.9%、56.6%和16.5%，总转化率为34.7%。

图9 β-CGT酶在pH 6.5、40℃条件下作用5 g/dL的麦芽糊精（DE=5）生产环糊精Fig.9 Productionofcyclodextrinsbyβ-CGTase incubating with 5%（wet basis，w/v） maltodextrin（DE=5） at pH 6.5 and 40 ℃

2.8 动力学分析

为了进一步确定重组β-CGT酶的动力学性质，分别测定了以不同浓度的玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、可溶性淀粉或3种麦芽糊精（DE=5、15、25） 为底物时酶的 β-环化活力， 通过Lineweaver-Burk双倒数法作图，计算酶的动力学参数。从研究结果发现，当分别以玉米淀粉、马铃薯淀粉或木薯淀粉为底物时，环化反应的动力学性质不符合米氏方程（数据未显示）。而分别以可溶性淀粉或3种麦芽糊精为底物时，环化反应的动力学性质能用米氏方程很好的进行描述 （相关系数R2＞0.99），酶的动力学参数计算结果如表3所示。

表3 以可溶性淀粉或麦芽糊精为底物时β-CGT酶的动力学参数*Table 3 Kinetic parameters of β-CGTases with soluble starch or maltodextrin as the substrate

从表3可以看出，可溶性淀粉的Km值平均值最低，说明β-CGT酶与可溶性淀粉的亲和性最大，尽管与DE 5、DE 15的麦芽糊精Km值没有显著性差异，以可溶性淀粉或DE 5麦芽糊精为底物时，酶的催化效率（Kcat/Km）最高，随着麦芽糊精DE值的增大，酶的催化效率显著降低，说明低DE值的麦芽糊精更适合生产环糊精。

3 结语

对获得的重组β-CGT酶发酵上清液进行分离纯化，然后以环化活力为评价指标全面分析了其生化性质。结果表明，采用Phenyl HP柱疏水层析、QHP柱阴离子交换层析两步能很好的对重组β-CGT酶进行纯化，酶的回收率达到45.3%。重组β-CGT酶的表观相对分子质量约为76 500，且在溶液中是以单聚体形式存在。该酶的最适pH为6.5，在甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中体现出更好的热稳定性；最适温度为60℃。45、50、55、60℃下的半衰期分别为6.8 h、4.5 h、55.6 min 和 6.5 min；60 ℃下的热稳定性随酶浓度的升高而增大。该酶的活性不依赖于金属离子，1 mmol/L Li+、Mg2+、Zn2+和 Hg2+对该酶的 β-环化活力有抑制作用，而1 mmol/L Ca2+和Ba2+能明显激活酶的β-环化活力。以玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉为底物时，该酶环化反应的动力学性质不符合米氏方程；而分别以可溶性淀粉、麦芽糊精（DE 5、15、25）为底物时，其环化反应的动力学性质能用米氏方程很好的进行描述。

[1]FRENCH D，RUNDLE R.The molecular weights of the schardinger alpha and beta dextrins[J].Journal of the American Chemical Society，1942，64（7）：1651-1653.

[2]SZENTE L，SZEJTLI J.Cyclodextrins as food ingredients[J].Trends in Food Science&Technology，2004，15（3-4）：137-142.

[3]JIN Zhengyu，BAI Yuxiang，WANG Jinpeng.Screen and modification of cyclodextrin glycosyltransferase[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2012，31（2）：113-123.（in Chinese）

[4]LI Z F，WANG M，WANG F，et al.γ-cyclodextrin：A review on enzymatic production and applications[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2007，77（2）：245-255.

[5]童林荟.环糊精化学-基础与应用[M].北京：化学工业出版社，2001.

[6]KHAN A R，FORGO P，STINE K J，et al.Methods for selective modifications of cyclodextrins[J].Chemical Reviews，1998，98（5）：1977-1996.

[7]THOMPSON D O.Cyclodextrins-Enabling excipients：Their present and future use in pharmaceuticals[J].Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1997，14（1）：1-104.

[8]GOMES L M M，PETITO N，COSTA V G，et al.Inclusion complexes of red bell pepper pigments with beta-cyclodextrin：Preparation，characterisation and application as natural colorant in yogurt[J].Food Chemistry，2014，148：428-436.

[9]SILVA F，FIGUEIRAS A，GALLARDO E，et al.Strategies to improve the solubility and stability of stilbene antioxidants：A comparative study between cyclodextrins and bile acids[J].Food Chemistry，2014，145：115-125.

[10]PAZZETTO R，DELANI T C D，FENELON V C，et al.Cyclodextrin production by Bacillus firmus strain 37 cells immobilized on loofa sponge[J].Process Biochemistry，2011，46（1）：46-51.

[11]URBAN M，BERAN M，ADAMEK L，et al.Cyclodextrin production from amaranth starch by cyclodextrin glycosyltransferase produced by Paenibacillus macerans CCM 2012[J].Czech Journal of Food Sciences，2012，30（1）：15-20.

[12]JIN Zhengyu，WANG Jinpeng，BAI Yuxiang.Catalytic mechanisms and influence factors on cyclidextrin preparation[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（1）：1-8.

[13]LI Z F，CHEN S，GU Z B，et al.Alpha-cyclodextrin：Enzymatic production and food applications[J].Trends in Food Science&Technology，2014，35（2）：151-160.

[14]MARECHAL L R，ROSSO A M，MARECHAL M A，et al.Some properties of a cyclomaltodextrin-glucanotransferase from Bacillus circulans DF 9 R type[J].Cellular and Molecular Biology，1996，42（5）：659-664.

[15]SALVA T J G，RODRIGUES J A D，COLOMBO C A.Purification and determination of some properties of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans N degrees 76 using response surface analysis[J].Revista De Microbiologia，1997，28：13-21.

[16]VASSILEVAI A，ATANASOVA N，IVANOVA V，et al.Characterisation of cyclodextrin glucanotransferase from Bacillus circulans ATCC 21783 in terms of cyclodextrin production[J].Annals of Microbiology，2007，57（4）：609-615.

[17]GASTON J A R，SZERMAN N，COSTA H，et al.Cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans DF 9R：Activity and kinetic studies[J].Enzyme and Microbial Technology，2009，45（1）：36-41.

[18]LARSEN K L，DUEDAHL O L，CHRISTENSEN H J S，et al.Purification and characterisation of cyclodextrin glycosyltransferase from Paenibacillus sp.F8[J].Carbohydrate Research，1998，310（3）：211-219.

[19]WIND R D，UITDEHAAG J C M，BUITELAAR R M，et al.Engineering of cyclodextrin product specificity and pH optima of the thermostable cyclodextrin glycosyltransferase from Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM1[J].Journal of Biological Chemistry，1998，273（10）：5771-5779.

[20]张佳瑜.软化芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在毕赤酵母和枯草杆菌中的表达[D].无锡：江南大学，2010.

[21]MAKELA M，KORPELA T，LAAKSO S.Colorimetric determination of β-cyclodextrin：two assay modifications based on molecular complexation of phenolphthalein[J].Journal of Biochemical Biophysical Methods，1987，14（2）：85-92.

[22]李兆丰.软化类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达及其产物特异性分析[D].无锡：江南大学，2009.

[23]J S，Dw R.Molecular cloning：a laboratory manual[M].3rd eds ed.New York：Cold Spring Harbor Press，2001.

[24]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M].北京：科学出版社，2005.

[25]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72（1）：248-254.