单链抗体对猪传染性胃肠炎病毒感染动物保护效果初探

张凡庆 陈玉雪 杨 亮 朱建国*

（1上海交通大学农业与生物学院/上海市兽医生物技术重点实验室，上海200240；2上海富朗特动物保健股份有限公司，上海 201502）

猪传染性胃肠炎（transmissible gastroenteritis）是由猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）感染引起的一种高度接触性传染病。该病临床症状表现为水泄、呕吐、脱水，甚至导致死亡[1]。2周龄的仔猪感染TGEV后立刻出现呕吐，接着持续多天的腹泻，严重的脱水使仔猪在感染后2～5天死亡。大于2周龄的猪感染TGEV后通常会康复，但是此后生长速度缓慢，料肉比提高。TGEV由Doyle和Hutchin两位学者在1946年首次在美国发现，我国在20世纪60年代报道了该病[2]。目前该病在全世界多个国家发生，并且该病经常与猪轮状病毒病、猪流行性腹泻、产肠毒素大肠杆菌病混合感染，给养猪业造成巨大的经济损失。在我国，TGEV被列为国家B类传染病，是我国重点防控的猪的疫病之一。

TGEV基因组为不分节段的单股正链RNA，RNA具有感染性。病毒基因组大小约为28.5 kb，是已知基因组最大的RNA病毒，其5’端具有甲基化的帽子结构，3’端具有共价结合的poly A尾。TGEV基因组分为7个区，除第1区和第3区分别具有2个开放阅读框（open reading frames,ORFs） （ORF1a／ORF1b，ORF3a／ORF3b），其余每个区只有1个ORF（ORF2、ORF4、ORF6和 ORF7），排列顺序为：5’-ORF1a-ORF1b-ORF2-ORF3a-ORF3b-ORF4-ORF5-ORF6-ORF7-3’。ORF1a、ORF1b、ORF3a、ORF3b 和 ORF7分别编码非结构蛋白，ORF1a和ORF1b编码病毒的复制和转录聚合酶，ORF2、ORF4、ORF5、ORF6编码病毒的结构蛋白，分别为纤突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）[3]。不同的病毒蛋白在病毒感染中发挥不同的作用。

单链抗体（single chain fragment variable,scFv）是一种基因工程抗体，它将抗体的重链可变区和轻链可变区通过一个短的柔性肽段连接[4]。scFv除了具有抗体的特异性和敏感性外，还具有分子量小、易于穿透细胞膜和半衰期短等特点。此外单链抗体能够在大肠杆菌中表达，并可以通过基因工程进行改造（如提高亲和性或改变特异性）。目前单链抗体被广泛应用于科学研究、肿瘤免疫、传染性疾病检测和治疗。本研究分析了一株抗TGEV scFv在仔猪TGE的预防效果，为下一步大规模临床应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 毒株与细胞

TGEV SHXB株和猪精睾丸（ST）细胞由本实验室保存。

1.2 主要试剂

Ni-NTA His标签纯化试剂盒购自美国Merck公司；DMEM培养基、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；抗His标签小鼠单克隆抗体、HRP标记羊抗小鼠二抗购自Abcam公司；TMB底物显色试剂盒购自北京天根生物科技公司。

2 方法

2.1 scFv的纯化

将携带pet28a-scFv质粒的大肠杆菌在2×YT培养基上划线。第2天挑取单个菌落至卡那霉素抗性液体培养基中培养。使用Ni-NTA His标签纯化试剂盒进行纯化，取少量纯化后的蛋白进行SDS-PAGE分析。

2.2 scFv的特异性分析

取出实验室保存的TGEV、PEDV、PRRSV、PCV2、产肠毒素大肠杆菌K88和K99菌株，37℃包被96孔ELISA板。接着向每孔中加入纯化的单链抗体100μL，孵育后加入鼠抗His标签一抗，PBST缓冲液洗涤后加入HRP标记的抗鼠二抗。最后加入TMB显色液，在酶标仪上读取OD420nm数值。

2.3 scFv的空斑实验

将2×105个/mL的Vero细胞接种至六孔板，第2天将感染复数（MOI）为1的PEDV与200 μL的scFv共同孵育（1 mg/mL），1小时后加入细胞培养六孔板中，孵育1小时后弃去病毒-scFv混合液，加入低熔点琼脂糖并培养48小时。待空斑出现后加入1%结晶紫溶液染色，记录空斑数量。

2.4 scFv对仔猪腹泻的保护实验

取6头21日龄长白仔猪，按以下处理分组：第1组为攻毒组，评价病毒的致病性，1头猪，先灌胃20 mL PBS，1小时后攻入1.2×106TCID50/mL的TGEV；第2组为scFv预防组，评价scFv的使用效果，3头猪，先灌胃20 mL浓度为400 μg/mL的scFv，1小时后攻入1.2×106TCID50/mL的TGEV；第3组为scFv处理组，评价scFv的生物安全性，1头猪，先灌胃20 mL浓度为400 μg/mL的scFv，1小时后加入20 mL PBS；第4组为阴性对照组，1头猪，先灌胃20 mL PBS，1小时后再灌胃20 mL PBS。在试验的第2、4、7天观察仔猪发病情况，记录精神状态、腹泻情况和死亡数量。

分别采集发病死亡的猪以及第7天处死的猪的小肠，解剖并分离空肠、回肠组织，将组织置于10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋后制作切片，HE染色观察其病理学变化。

2.5 scFv对仔猪的生物安全性评价

分别在感染后第2、4、7天采集仔猪粪便5 g，加入少量PBS后离心，取上清液。ELISA包被TGEV全病毒抗原5 μg/mL，包被封闭后加入提取的粪便上清液，检测粪便中scFv的含量。

3 结果

3.1 抗猪传染性胃肠炎病毒scFv的纯化

将复苏的菌株接种至含有50 μg/mL卡那霉素的2×YT培养基中，待OD600nm达到0.6时加入100 mM的IPTG，培养过夜。第2天将菌液离心，收集沉淀，沉淀超声破碎后，使用Ni-NTA his标签蛋白纯化试剂盒纯化。10%SDS-PAGE电泳结果显示在28 kDa处有特异性条带，证实scFv蛋白获得了表达，并成功纯化（见图 1）。

图1 scFv的SDS-PAGE电泳

3.2 scFv的特异性实验

将TGEV、PEDV、PRRSV、PSV2、K88和K99病原抗原分别包被ELISA板，检测scFv与这些病原的结合能力。ELISA结果显示，TGEV抗原包被孔的OD值大于0.8，其他病毒或细菌包被孔抗原的OD值小于0.2。将抗原包被孔的OD值／PBS的OD值大于2.5判断为发生反应，说明scFv能够与TGEV结合，并且具有特异性（见图2）。

图2 ELISA检测scFv特异性结果

3.3 scFv的空斑实验

将TGEV和scFv预先共同孵育1小时，然后加入细胞，细胞上层用低熔点琼脂糖固定，出现空斑后用结晶紫进行染色。同时设立TGEV＋PBS处理组和PBS处理组。图3是病毒空斑经结晶紫染色后的结果，图4是对图3中的空斑数量计数结果。结果显示，TGEV＋PBS处理组的平均空斑数量为167，TGEV+scFv处理组的平均空斑数量为26，两组差异显著，说明scFv具有中和TGEV的作用。

图3 病毒空斑经结晶紫染色后结果

图4 scFv的空斑实验

3.4 scFv的仔猪保护实验

将6头仔猪分为攻毒组、scFv预防组、scFv处理组和阴性对照组。在感染后第2、4、7天观察临床症状，结果见表1。从表1可以看出，TGEV攻毒组在第2天开始出现精神沉郁，活动减少；第4天开始仔猪出现拉稀，粪便呈现糊状，肛门周围有水样粪便。scFv预防组仔猪攻毒后第4天粪便松软；第7天粪便正常，没有出现拉稀症状。scFv处理组和阴性对照组仔猪观察期间内的粪便正常，没有腹泻和精神沉郁等情况。所有组没有出现仔猪的死亡（见表1）。综合以上结果，scFv预先灌胃后，能够给仔猪提供保护，抑制TGEV引起的腹泻。

采集仔猪的空肠，石蜡包埋后染色。结果发现TGEV攻毒组的仔猪空肠绒毛上皮脱落，隐窝变浅，炎性细胞浸润。scFv＋TGEV处理组的仔猪肠道与阴性对照组相同，说明scFv处理能够对仔猪感染TGEV产生保护（见图5）。

图5 HE染色切片结果

3.5 单链抗体的生物安全性评价

分别在感染后第2、4、7天采集仔猪粪便加入少量PBS后离心，取上清液。ELISA检测结果显示单链抗体处理组与PBS处理组OD值相同（见图6）。

图6 scFv的生物安全性评价

表1 仔猪发病情况

4 讨论

TGEV属于冠状病毒科，能够引起仔猪呕吐、腹泻和脱水。目前对TGEV的防治方法为疫苗免疫怀孕母猪，母猪体内产生的抗体通过乳汁传递给仔猪，从而对仔猪提供保护。然而仔猪接近断奶时抗体水平下降，容易感染TGEV，此外每头仔猪吃奶量存在不同，容易导致抗体量吸收不足[5]。之前有研究报道使用卵黄抗体治疗TGEV感染，取得了很好的效果，该研究说明抗体可以用于治疗腹泻性病毒感染。由于卵黄抗体来源于鸡，给仔猪使用后可能会造成免疫反应，此外卵黄抗体生产成本高，这也是其难以大规模应用的原因[6]。本文研究了单链抗体对仔猪腹泻的效果，单链抗体仅具有抗体可变区，避免了使用过程中的种属差异；此外scFv能够在大肠杆菌中大量表达，降低了使用成本。

本研究发现，将scFv预先给仔猪灌服再感染TGEV后，仔猪的精神状态正常、没有出现腹泻，肠道损伤较轻。目前正在进行单链抗体的纳米材料包被工作，该纳米材料能够保护单链抗体免受胃酸的降解。下一步将使用纳米材料包被的单链抗体进行试验，研究包被的scFv是否具有更好的治疗效果。

[1]Schwegmann-wessels C,Herrler G.Transmissible gastroenteritis virus infection:a vanishing specter[J].Dtsch Tierarztl Wochenschr,2006,113(4):157-159.

[2]Antón IM,González S,Bullido MJ,et al.Cooperation between transmissible gastroenteritis coronavirus (TGEV)structural proteins in the in vitro induction of virus-specific antibodies[J].Virus Research,1996,46(1-2):111-124.

[3]Spaan W,Cavanagh D,Horzinek MC.Coronaviruses:structure and genome expression[J].Journal of General Virology,1988,69(Pt 12)(6):2939-2352.

[4]Bird RE,Hardman KD,Jacobson JW,et al.Single-chain antigen-binding proteins[J].Science,1988,242(4877):423-426.

[5]Yuan X,Lin H,Fan H.Efficacy and immunogenicity of recombinant swinepox virus expressing the A epitope of the TGEV S protein[J].Vaccine,2015,33(32):3900-3906.

[6]Li X,Wang L,Zhen Y,et al.Chicken egg yolk antibodies(IgY)as non-antibiotic production enhancers for use in swine production:a review [J].Journal of Animal Science and Biotechnology,2015,6(1):40.