苋菜amaARF6基因克隆及其外源激素处理下在幼苗中响应分析

潘君飞，彭丽云，赵春丽，王 晓，张梓浩，陈裕坤，赖钟雄，刘生财

（福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福州 350002）

ARFs（Auxin response factors）是重要生长素响应因子，其编码蛋白质可与生长素响应基因启动子特定响应元件结合，在植物器官不同发育时期表达调控，调节植物生长发育过程[1-2]。李惠华等研究发现 DlARF1、DlARF3、DlARF4、DlARF6、DlARF8、DlARF10、DlARF16和DlARF17在龙眼体胚发育各阶段均有表达[3-4]。植物激素和外界环境因子对ARF基因功能发挥重要调控作用。Tian等研究发现拟南芥AtARF8受光诱导[5]，林丽霞等研究发现外源生长素IAA上调龙眼DlARF5a表达[6]。ARF6作为ARF基因家族一员，在其他高等植物中研究较少。唐雨微发现番茄SlARF6在茎和盛花期表达水平较高，SlARF6基因参与果实形成和发育过程[7]。此外，王飞燕等发现SlARF6明显受GA3和2,4-D等外源激素负调控[8]。

苋菜（Amaranthus tricolor L.）属石竹目苋科苋属植物，具有营养和药用价值[9]，是甜菜色素提取重要原料[10]。甜菜色素是抗氧化能力较强的天然植物色素。外源激素可影响植物生长发育，调控次生代谢产物代谢过程[11]。ARF6基因受多种激素调控，影响植物生长发育[12]。但有关ARF6是否响应外源激素并影响植物幼苗生长研究尚未见报道。因此，本研究根据苋菜转录组数据库克隆1个苋菜生长素应答因子家族成员amaARF6，分析外源激素对苋菜幼苗处理下，amaARF6基因表达特征及其与苋菜形态间关系，旨在为研究amaARF6基因对苋菜幼苗生长和甜菜红素合成调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究苋菜材料为‘大红’花叶苋菜，由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供。处理后苋菜材料取样，液氮速冻并保存于-80℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 苋菜总RNA提取及cDNA合成

多糖多酚总RNA提取试剂盒（购自北京百泰克生物技术有限公司）提取苋菜幼苗总RNA，Gene RacerTM试剂盒和SYBR Ex ScriptTM逆转录试剂盒（TaKaRa）反转录为cDNA分别用于基因克隆和定量PCR分析。

1.2.2 amaARF6基因克隆

根据苋菜转录组数据库（SRA：SSR924089～SSR924092），查找amaARF6基因序列片段，与NCBI登录甜菜BvARF6基因序列比对，找出保守区，利用Primer5.0根据保守区设计3'-RACE和5'-RACE特异引物（见表1），以上述反转录cDNA为模板作巢式PCR反应，扩增3'和5'末端序列。利用DNAMAN将所得序列片段拼接获得amaARF6基因cDNA全长，设计ORF引物验证（见表1）。

按TaKaRa LA Taq说明书作PCR扩增，反应条件为：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，54～56℃退火30 s，72℃延伸1～3 min（根据目的片段大小决定），30个循环，72℃延伸10 min。将目的条带割胶纯化回收，连接pMD18-T载体后转化大肠杆菌，挑取PCR验证阳性克隆菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

表1 引物序列Table 1 List of primers used

1.2.3 生物信息学分析

DNAMAN7.0软件对基因序列片段拼接及氨基酸序列推导；利用在线软件对该基因编码蛋白作生物信息学分析；MEGA5.0软件Neighbor-Joining（NJ）法构建不同物种间ARF6蛋白系统进化树。

1.2.4 外源激素处理

水培法对‘大红’花叶苋菜作外源激素处理。以MS不添加有机成分为基本营养液并作对照，添加不同浓度IAA，IBA，2,4-D，GA3及PP333等外源激素处理。参照文献[13]方法，激素质量浓度梯度设置为IAA：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg · L-1；IBA和2,4-D：0.5，1.0，1.5，2.5 mg· L-1；GA3和PP333：0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mg · L-1。首先在培养皿底部垫3层滤纸，将各处理及对照营养液倒入各培养皿中，直至滤纸完全湿润，滤纸上均匀播种苋菜种子，每个培养皿30粒，每个处理重复3次，随机排列。培养期间添加营养液2次·d-1，参照文献[14]，培养7 d后苋菜幼苗拍照取样。

1.2.5 qRT-PCR分析

以EF1a为内参基因，根据克隆amaARF6基因cDNA全长设计出特异引物（见表1），检测不同处理下苋菜amaARF6基因表达量。荧光定量PCR反应体系为20 μL，参照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（TaKaRa），反应条件为：95℃预变性30 s，95℃变性10 s，退火时间20 s（温度根据引物Tm值适当调整），72℃延伸12 s，40个循环。每个样品设置3个生物学重复，扩增amaARF6基因和内参基因，3次重复。基因相对表达量计算参照文献[14]方法。

1.2.6 数据处理

运用Excel 2010和DPS 14.10软件作数据统计和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 苋菜amaARF6基因克隆

以‘大红’花叶苋菜为材料，提取RNA并反转录为cDNA作为模板，通过苋菜试管开花过程转录组数据库信息筛选苋菜amaARF6基因cDNA片段，RACE技术及ORF验证作PCR扩增，最终获得苋菜amaARF6 cDNA全长序列，命名为amaARF6（NCBI登录号：MG581459）。amaARF6基因全长为3 758 bp，其中5'UTR 679 bp，3'UTR 359 bp，poly A尾长24 bp，该基因开放阅读框为2 697 bp（见图1），编码898个氨基酸。

图1 苋菜amaARF6基因cDNA全长Fig.1 Full-length amaARF6 cDNA sequence of Amaranthus tricolor L．

2.2 苋菜amaARF6基因生物信息学分析

利用ProtParam预测分析苋菜amaARF6基因编码蛋白质理化性质。结果显示，该蛋白分子式为C4447H6892N1244O1363S33，相对分子质量为100.65 ku，等电点为5.88，属于亲水但不稳定蛋白。根据NCBICDS在线分析工具分析amaARF6蛋白结构域，该蛋白包括生长素响应因子结构域和生长素功能位点（见图2）。通过MEME在线分析，苋菜motif与甜菜和拟南芥非常保守，说明本研究获得ARF6与甜菜、番茄和拟南芥ARF6功能相同（见图3）。

图2 NCBI中amaARF6蛋白氨基酸序列保守结构域检索Fig.2 Search for conserved domain of amaARF6 protein amino acid sequence by NCBI

图3 与甜菜、番茄和拟南芥ARF6蛋白motif分析Fig.3 Motif analysis with BvARF6,SlARF6 and AtARF6 protein

在线分析工具Signal P4.1 Server预测苋菜amaARF6蛋白信号肽发现，该蛋白无明显信号肽，可能在胞质中起作用。

利用在线分析软件TMpred对苋菜amaARF6蛋白作跨膜结构预测，结果表明该蛋白不属于跨膜蛋白，亚细胞定位预测表明该蛋白定位于叶绿体中。利用NetPhos 2.0 Serve在线磷酸化位点分析工具预测苋菜amaARF6蛋白磷酸化位点，发现丝氨酸磷酸化在苋菜amaARF6蛋白中占主导地位（见图4），推测丝氨酸磷酸化可能在苋菜amaARF6蛋白行使功能中有重要作用。二级结构和三级结构预测表明（利用在线分析工具PHD和SWISS-MODEL），amaARF6蛋白二级结构以无规则卷曲结构为主（见图5～6）。

图4 苋菜amaARF6蛋白磷酸化修饰预测Fig.4 Predicted phosphorylation sites in amino acid sequence of amaARF6

图5 amaARF6蛋白序列二级结构预测Fig.5 Secondary structure prediction of amaARF6

图6 amaARF6蛋白三维结构预测Fig.6 Three-dimensional structure prediction of amaARF6

2.3 ARF6基因系统进化树分析

为分析比较克隆获得amaARF6基因与其他物种ARF6基因亲缘关系，将拟南芥、甜菜、番茄、玉米等其他11种植物与苋菜amaARF6基因cDNA核酸序列推导的氨基酸序列作进化树分析（见图7）。苋菜amaARF6蛋白与甜菜相似度最高，达100%，苋菜与甜菜同属为石竹目，说明ARF6蛋白在生物进化过程中保守。此外，苋菜amaARF6蛋白与番茄相似度达98%，说明苋菜amaARF6蛋白与番茄亲缘关系较近。

图7 ARF6基因系统进化树Fig.7 Phylogenetic tree for ARF6 gene

2.4 外源激素处理对苋菜生长和amaARF6基因表达影响

2.4.1 不同浓度生长素处理对苋菜生长和amaARF6基因表达影响

在IAA处理苋菜幼苗中，随IAA浓度升高，amaARF6基因表达量整体呈先升后降趋势。其中，当IAA浓度为1.5 mg·L-1时，amaARF6基因表达量最高，约为对照表达量3.1倍（见图8）。在不同浓度IBA处理条件下，amaARF6基因表达量随IBA浓度升高而逐渐上升，浓度为1.0 mg·L-1时略有下降（见图8）。在2,4-D处理条件下，苋菜生长明显受抑制，根系生长受抑制，茎段变短甚至弯曲，甜菜红素累积也随2,4-D浓度增加呈下降趋势（见图9）；2,4-D处理下amaARF6基因表达量随2,4-D浓度升高呈先升后降趋势，当2,4-D浓度为0.5 mg·L-1时，amaARF6基因表达量最高，约为对照5倍（见图8）。此外，在2,4-D、IAA、IBA3种生长素处理下，amaARF6基因表达均上调。

2.4.2 不同浓度GA3和PP333处理对苋菜生长和amaARF6基因表达影响

在不同浓度GA3处理条件下，随GA3浓度提高，苋菜茎段均逐渐伸长，甜菜红素累积明显受抑制（见图10），amaARF6基因表达量呈先降后升再降趋势变化（见图11）。PP333处理条件下，苋菜茎段随浓度升高而变短，甜菜红素累积呈上升趋势（见图10），与GA3处理相反，可能因PP333抑制GA3作用；随PP333浓度提高，amaARF6基因表达量也整体呈先降后升趋势（见图11）。但在GA3和PP333处理下，amaARF6基因表达均发生下调，与2,4-D、IAA、IBA三种生长素处理结果相反。

图8 amaARF6基因在不同生长素处理下表达趋势Fig.8 Change of expression of amaARF6 gene under different auxin treatment

图9 苋菜幼苗在2,4-D处理下生长状态Fig.9 Growth status of amaranth seedlings in 2,4-D treatment

图10 苋菜幼苗在GA3和PP333处理下生长状态Fig.10 Growth status of amaranth seedlings in GA3and PP333treatment

图11 amaARF6基因在GA3和PP333处理下表达趋势Fig.11 Change of expression of amaARF6 gene under GA3and PP333treatment

3 讨论与结论

3.1 苋菜amaARF6基因功能

本研究克隆获得1个苋菜ARF6基因，命名为amaARF6。ARF是一个具保守域转录因子，有明显序列特征[8]。生物信息学分析表明，苋菜amaARF6基因与其他ARF6基因有高度同源性，amaARF6蛋白包括生长素响应因子结构域和生长素功能位点，均是ARF基因家族所特有序列特征[15]；通过motif分析，苋菜ARF6 motif与甜菜、番茄和拟南芥motif结构相近，说明该转录因子功能系统较相似；进化树分析表明，苋菜amaARF6与甜菜BvARF6蛋白进化距离最近，与其他物种相似性较高。表明新基因amaARF6是苋菜ARF家族基因成员，与其他植物ARF6基因功能相似。

3.2 生长素对amaARF6基因表达影响

植物生长发育过程受激素调控，尤其是生长素类物质。甜菜色素对不同类型生长素物质和浓度响应差别较大[16-18]。本研究发现2,4-D抑制苋菜幼苗生长和甜菜红素积累，与郑学立研究结果一致[13]。郑学立研究发现2,4-D影响甜菜红素代谢通路中部分相关基因表达，影响甜菜色素合成，但机理尚不清楚。本研究通过对苋菜幼苗中amaARF6基因定量表达分析后认为，2,4-D可促进苋菜幼苗中amaARF6基因表达，尤其在低浓度条件下效果更显著，使幼苗对2,4-D产生响应，影响甜菜色素代谢相关基因表达及甜菜色素代谢。amaARF6基因响应方式及是否影响甜菜色素代谢相关基因表达还需进一步验证。王飞燕等研究发现，外源激素2,4-D在一定浓度条件下可抑制番茄果实发育过程中ARF6表达[8]，与本研究结果不同，可能是材料遗传背景差异较大或发育时期不同导致。

Zhao等研究表明，IAA对盐地碱蓬愈伤组织色素含量无显著影响[19]，本研究发现IAA和IBA对苋菜幼苗生长及甜菜红素积累无显著影响。另外，amaARF6积极响应IAA和IBA调控，不同浓度IAA和IBA处理下均在浓度1.0 mg·L-1时轻微抑制。

以上3种生长素处理下，amaARF6基因均存在上调现象，推测amaARF6基因可能具备ARF家族正调控因子表达特征和功能，影响不同发育或代谢过程中相关基因表达。

3.3 GA3和PP333对amaARF6基因表达和苋菜幼苗生长影响

GA维持黑暗条件下暗形态建成[20]，可能间接抑制甜菜红素合成。Kinsman等研究报道，苋菜幼苗中甜菜红素含量在GA存在条件下减少[16]，与本研究结果一致。赤霉素信号途径和生长素运输相关[21]。生长素可有效促进赤霉素合成途径各种相关基因转录[22]，同时，赤霉素促进生长素运输[23]，与本研究GA3处理促进苋菜茎段伸长一致。PP333处理下，苋菜生长、甜菜红素累积趋势及amaARF6基因表达量均与GA3相反，因此推测amaARF6基因可能参与调控苋菜幼苗生长和甜菜红素合成。唐雨微研究发现番茄ARF基因家族有SlARF6A和SlARF6B两个成员[7]，本研究amaARF6基因表达量在GA3和PP333处理下均下调，因此推测外源激素GA3和PP333处理影响生长素响应因子amaARF6其他成员表达，影响内源生长素信号传导苋菜生长及色素合成。amaARF6基因表达与苋菜中甜菜红素合成关系尚待深入研究。

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