N-糖基化对重组木聚糖酶XynA酶学特性的影响

张笑雨,高思宇,李秀婷,杨 然,*

(1.北京工商大学,食品添加剂与配料北京高校工程研究中心,北京 100048; 2.北京工商大学,北京市食品风味化学重点实验室,北京 100048； 3.北京工商大学,北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京100048)

木聚糖(Xylan)存在于植物细胞壁中,是含量仅次于纤维素的自然界第二丰富的可再生资源[1]。木聚糖酶(Xylanase)作为降解植物细胞壁半纤维素的关键水解酶之一,广泛地存在于细菌、真菌、酵母菌和反刍动物的瘤胃中[2],目前应用于轻工[3]、饲料[4]、能源以及食品工业中[5]。

由于天然菌株表达木聚糖酶难以大规模的生产,且优良性能的酶较少而限制其应用范围[6],为此越来越多的研究者开始关注重组木聚糖酶的异源表达,如大肠杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统等。其中巴斯德毕赤酵母作为高效表达外源蛋白的真核表达系统,具有遗传稳定,表达高效及对蛋白进行翻译后加工等优点,已有数百种外源蛋白在该系统中实现表达[7]。同样毕赤酵母表达体系具有许多真核表达系统所特有的特点,如蛋白酶加工、折叠、二硫键形成和糖基化修饰作用等[8],其中N-糖基化修饰是蛋白质主要的翻译后修饰之一[9],许多蛋白质功能的实现多与糖基化修饰密切相关,如对于许多蛋白质的正确折叠分泌是必需的,同时能够稳定蛋白质的成熟构象,增加其稳定性等[10]。王茜[11]通过脱糖基化酶Endo H去除重组植酸酶 phy(QF)的糖链,发现糖基化的植酸酶与未糖基化的植酸酶相比最适温度提高了5 ℃,Tm值提升2 ℃,对酶的稳定性有促进作用。Guo[12]研究发现毕赤酵母重组肌醇六磷酸酶在90 ℃处理10 min可维持40%的酶活,而去糖基化后在40 ℃处理10 min酶活剧烈下降。Chang等[13]的研究也发现去除N-糖基化修饰会降低木聚糖酶酶活和耐热稳定性,同时也影响了其最适pH。但是,也有文献报道糖基化修饰不会显著影响酶的热稳定性反而会使其热稳定性降低。虽然已有许多研究者成功的实现了木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达,但是对GH11家族木聚糖酶N-糖基化修饰的研究较少,因此,研究N-糖基化修饰对木聚糖酶在毕赤酵母中表达以及对酶学特性的影响,对进一步改造重组木聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达具有重要意义。

实验室前期,从一株枝链霉菌L2001中克隆得到木聚糖酶基因xynA并在大肠杆菌中实现了克隆与表达,对其发酵条件控制和酶学特性进行了比较系统的研究。笔者通过SignalP 4.1 Server预测木聚糖酶基因xynA含有信号肽,表明其分泌到胞外,有被糖基化修饰的可能,同时通过NetNGlyc 1.0 Server预测,xynA序列中含有5个潜在的N-糖基化位点,而N-糖基化作用可能对重组蛋白的分泌及特性产生影响。因此,本文采用衣霉素处理毕赤酵母细胞,通过对比处理前后木聚糖酶的表达量及酶学特性,初步探究N-糖基化对木聚糖酶的分泌表达及酶学特性的影响,为木聚糖酶的定向改造提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α天根生化科技有限公司;重组质粒pET28a-xynA毕赤酵母(PichiapastorisGS115)、表达载体pPIC9K 由实验室保存;Endo H酶(500000 U/mL)、T4 DNA连接酶(400000 U/mL)、限制性内切酶EcoR I(20000 U/mL)、Not I(20000 U/mL)、SacI(20000 U/mL) NEB公司;LA Taq聚合酶(5 U/mL) TaKaRa公司;衣霉素 上海阿拉丁公司;质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒 OMEGA公司;Bradford 蛋白浓度测定试剂盒 北京索莱宝公司;木聚糖及酶活测定相关试剂 Sigma公司;引物合成 由奥科鼎盛公司完成,基因测序于北京华大基因公司完成;LB培养基 氯化钠1%,胰蛋白胨1%,酵母粉0.5%,固体培养基加2%琼脂,121 ℃湿热灭菌20 min;BMGY培养基 1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、100 mmol/L磷酸钾缓冲液，pH6.0、1.34% YNB、4×10-5%生物素、1%甘油；BMMY培养基 1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、100 mmol/L磷酸钾缓冲液，pH6.0、1.34% YNB、4×10-5%生物素、0.5%甲醇；筛选培养基MD 1.34% YNB、4×10-5%生物素、2%葡萄糖、2%琼脂；筛选培养基MM 1.34% YNB、4×10-5%生物素、0.5%甲醇、2%琼脂；YPD培养基 1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖，固体培养基加2%琼脂(参考www.invitrogen.com网站的操作手册)。

T100-Thermal cycler PCR仪、Gene Pulser XcellTM电穿孔系统 美国 BIO-RAD公司;EPS301 琼脂糖凝胶电泳仪 北京六一仪器厂;Microfuge 20R台式微量离心机 德国 Beckman 公司;ImageQuant 300凝胶成像仪、Multitemp Ⅲ恒温循环水浴器 美国GE 公司;HR60-IIA2生物安全柜 青岛海尔特种电器有限公司;恒温培养箱 上海 STIK 公司;DHZ-DA 大容量全温振荡器 江苏太仓市实验设备厂;YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 重组表达质粒pPIC9K-xynA的构建 以重组质粒pET28a-xynA为模板,设计含EcoR I、Not I的上下游引物(xynA-F01:5′-CGGAATTCACGGTC GTCACCACG-3′;xynA-R02:5′-ATAAGAATGC GGCCGCTCACGACGACACCGTG-3′),经PCR扩增出不含信号肽的基因序列xynA[14],PCR扩增条件为:94 ℃ 2 min预变性;94 ℃ 30 s变性;61 ℃ 30 s退火;72 ℃ 1 min延伸,进行30个循环;72 ℃ 10 min延伸。分别对目的基因xynA和真核表达载体pPIC9K进行双酶切并回收,于24 ℃连接2.5 h、转化至大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α感受态细胞中,通过重组质粒pPIC9K-xynA的DNA测序确认构建成功[15]。

1.2.2 重组毕赤酵母的构建及高拷贝转化子的筛选 将测序成功的pPIC9K-xynA重组质粒经SacI 限制性内切酶线性化后,电击转化至毕赤酵母感受态细胞中,涂布于MD平板上30 ℃培养直至长出菌落,菌落PCR验证阳性转化子,挑取转化子接种含有不同浓度(1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 mg/mL)G418的YPD平板,30 ℃培养3～5 d,筛选出的高拷贝转化子,经摇瓶复筛后,最终获得一株重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-xynA[16]。毕赤酵母感受态细胞的制备:挑取毕赤酵母GS115单菌落接种于5 mL YPD液体培养基中,30 ℃摇床过夜;以1%接种量转接100 mL YPD液体培养基,30 ℃摇床过夜至OD=1.3～1.5;4 ℃,5000 r/min离心5 min弃上清,用100 mL冰预冷无菌水重悬菌体;4 ℃,5000 r/min离心5 min弃上清,用50 mL冰预冷无菌水重悬菌体;4 ℃,5000 r/min离心5 min弃上清,用4 mL冰预冷的1 mol/L山梨醇重悬菌体;4 ℃,5000 r/min离心5 min弃上清,菌体用0.2 mL 1 mol/L山梨醇重悬并转移至新的无菌1.5 mL离心管中备用(感受态细胞需现用现制)。电击转化方法:在80 μL酵母感受态细胞中加入1～5 μg线性化的质粒轻柔混匀转移至0.2 cm冰预冷的电击杯于冰上放置5 min,设置电击参数为1.5 kV、25 μF、400 Ω,电击并迅速加入1 mL 1 mol/L山梨醇,涂布MD平板(参考www.invitrogen.com网站的操作手册)。

1.2.3 重组木聚糖酶XynA的诱导表达 将验证成功的阳性转化子接种于50 mL BMGY培养基中，于29 ℃,250 r/min条件下富集培养48 h,4 ℃,5000 r/min,5 min离心收集菌体,于无菌条件下重悬于50 mL BMMY培养基中诱导表达,每隔24 h取样并添加终浓度为1%的甲醇诱导表达,培养8 d后,发酵液4 ℃,8000 r/min离心5 min,取上清即为粗酶液。

1.2.4 衣霉素抑制毕赤酵母细胞诱导表达重组木聚糖酶XynA 将验证成功的阳性转化子接种于50 mL BMGY培养基中，于29 ℃,250 r/min条件下富集培养48 h,4 ℃,5000 r/min,5 min离心收集菌体,于无菌条件下重悬于50 mL 含不同浓度衣霉素(2、5、10、15 μg/mL)BMMY培养基中诱导培养8 d,发酵液4 ℃,8000 r/min离心5 min,取上清即为粗酶液,以同样培养的未加衣霉素培养的菌株为对照[17]。

1.2.5 内切糖苷酶Endo H处理重组木聚糖酶XynA 在20 μg重组木聚糖酶中加入1 μL 10×糖蛋白变性缓冲液,补入灭菌高纯水至总体积为10 μL;于100 ℃反应10 min;加入2 μL 10×GlycoBuffer 3缓冲液,1 μL Endo H酶,7 μL无菌水至反应总体积为20 μL,在37 ℃下温育1.5 h。将反应后产物进行SDS-PAGE检测。

1.2.6 SDS-PAGE与PAS糖染色分析 SDS-PAGE 按照Laemmli[18]的方法进行,浓缩胶浓度5.0%,分离胶浓度为10.0%,上样量20 μL,电泳结束后,用考马斯亮蓝染色15 min后脱色。PAS糖染色[19]:取出SDS-PAGE后的凝胶,将其在10%冰醋酸-35%甲醇溶液中浸泡1 h以固定蛋白条带;然后将固定后的凝胶取出用5%的冰醋酸清洗2次,每次10 min;然后把凝胶浸泡在用5%冰醋酸配制的1%的高碘酸溶液中,于4 ℃中黑暗条件下氧化1 h;用5%冰醋酸将凝胶漂洗几次后,用50 mL的偏重亚硫酸钠溶液(0.2 g偏重亚硫酸钠溶于100 mL 5%冰醋酸),浸泡10 min;用Schiff试剂于4 ℃中避光染色1 h;染色完毕后将凝胶用大量5%冰醋酸进行清洗,即可见红色糖蛋白电泳条带。

1.2.7 木聚糖酶活力测定 木聚糖酶活力测定参考Miller GL[20]的DNS法。以1 mg/mL的木糖为标准样品绘制标准曲线,根据标准曲线与540 nm处的吸光值计算所得还原糖的量。木聚糖酶的活力单位(U)定义为:在上述条件下,每分钟水解木聚糖生成1 μmol还原糖(木糖)所需要的酶量。

1.2.8 抑制糖基化前后木聚糖酶酶学特性分析

1.2.8.1 pH对重组木聚糖酶活力的影响 采用实验室缓冲体系:甘氨酸(Gly)-盐酸 pH2.0～3.0;柠檬酸-柠檬酸三钠(Citrate)pH3.0～6.0;磷酸二氢钠-磷酸氢二钠pH6.0～8.0;Tris-盐酸 pH8.0～9.0;甘氨酸(Gly)-氢氧化钠pH9.0～10.0缓冲液调整酶液,使酶液处于不同的缓冲条件,按照方法1.2.7中酶活测定方法测定酶活力;稳定性的测定,使酶液处于不同缓冲液下,50 ℃下保温30 min,立即冰水浴终止反应,然后按照方法1.2.7中酶活测定方法测定剩余酶活力,以未经保温处理的酶液的木聚糖酶活力为100%对照。

1.2.8.2 温度对重组木聚糖酶活力的影响 将酶液用最适pH缓冲液适当稀释,然后分别在不同温度条件下(40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 ℃)下反应,测定木聚糖酶活力,以最大值为100%,确定最适反应温度;用最适pH缓冲液对酶液按照酶液比缓冲液1∶5进行适当稀释,分别在40～85 ℃(相邻温度间隔5 ℃)的不同温度条件下保温处理30 min,保温结束后立即冰浴冷却,然后按照方法1.2.7中酶活测定方法测定木聚糖酶的剩余酶活力,以未经保温处理的酶液的酶活力作为100%对照[14]。

1.2.8.3 离子浓度及螯合剂对木聚糖酶活性的影响 根据方法1.2.7酶活力的测定方法,考察最终浓度为10 mmol/L的金属离子、螯合剂(EDTA)对酶活力的影响。以不添加任何金属离子、鳌合剂的酶液作对照,每个反应设置3个平行。金属离子包括 Na+、K+、Li+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ba2+、Al3+、Fe3+。

1.2.8.4 胃蛋白酶和胰蛋白酶对木聚糖酶活力的影响 用相应的pH2.0的 0.1 mol/L Gly-HCl和pH7.5的0.1 mol/L Tris-HCl 分别稀释胃蛋白酶和胰蛋白酶液,蛋白酶的终浓度为0.1 mg/mL,在最适温度和最适pH下考察酶活力,以未处理的木聚糖酶作为对照,每个反应设置3个平行,考察蛋白酶对酶活力的影响[21]。

1.3 数据处理

数据统计分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和两因素重复测量数据方差分析(two-way repeated-measures ANOVA)方法,采用SPSS软件。所有酶活和相对酶活数据从三个独立实验或平行所得,采用Excel绘图。

2 结果与分析

2.1 重组表达质粒pPIC9K-xynA的构建

以重组质粒pET28a-xynA为模板,以xynA-F01、xynA-R02为引物进行PCR扩增后得到线性的目的片段xynA,琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图1所示,目的基因片段大小为574 bp。目的基因纯化后与pPIC9K表达载体双酶切、连接,转化E.coliDH5α感受态细胞,阳性克隆子筛选后,提取质粒经PCR验证(图2),最后经测序检验重组表达质粒pPIC9K-xynA(图3)构建成功。

图1 目的片段xynAFig.1 Target gene xynA注:M为Marker;泳道1、2为PCR产物。

图2 菌落PCRFig.2 Colony PCR注:M为Marker;泳道1～3为菌落PCR产物。

图3 重组表达质粒pPIC9K-xynA示意图Fig.3 Sketch map of recombinant expression plasmid of pPIC9K-xynA

2.2 重组毕赤酵母的构建及高拷贝转化子的筛选

重组表达载体pPIC9K-xynA经SacI 线性化后,电击转化至毕赤酵母感受态细胞中,涂布于MD平板(图4A),挑取转化子分别点种于含不同浓度 G418的YPD平板,初筛确定G418浓度为6.0 mg/mL,经摇瓶复筛,最终筛选到一株木聚糖酶表达量较高的工程菌株GS115/pPIC9K-xynA(如图4B中标记4;另外,2,3为表达量较低的工程菌)。

图4 MD平板上生长的转化子(A)及G418筛选结果(B)Fig.4 The transformants on the MD medium and the screening results

2.3 重组木聚糖酶的诱导表达及衣霉素处理酵母细胞

衣霉素是一种常见的糖基化抑制剂,能在细胞内抑制毕赤酵母表达蛋白的糖基化修饰,且其并不影响酵母细胞的生长[17],因此在培养基中加入衣霉素培养后,能够使原来发生糖基化的蛋白去糖基化。随着诱导时间的增加,菌体OD600也逐渐升高(图5),第7 d时开始下降,这是由于培养基中营养成分消耗影响了酵母生长,但是添加衣霉素组与未添加衣霉素组的酵母生长情况大体一致,因此衣霉素的添加并未影响毕赤酵母工程菌的正常生长。

图5 添加不同浓度衣霉素对于酵母菌体生长的影响Fig.5 Influence of yeast growth by adding different concentration of tunicamycin

衣霉素对重组木聚糖酶表达效果的影响如图6所示,重组木聚糖酶酶活随着诱导时间的增加呈逐步上升的趋势,但随着衣霉素添加浓度增高酶活有所下降,即不同程度抑制N-糖基化修饰的酵母菌分泌的木聚糖酶酶活与未添加组相比均有所下降,其中添加量为10、15 μg/mL分泌的重组酶酶活下降幅度比较大,剩余酶活力分别为82.35%、53.60%,而2、5 μg/mL相比酶活下降幅度不大,仅为0.92%和6.85%,造成酶活降低的原因可能是因为糖基化修饰可以使蛋白质的正确折叠分泌而维持其功能,如果糖基化受到抑制,则不能实现应有的功能状态[22-23]。

图6 不同浓度衣霉素对于XynA活力的影响Fig.6 The activity of XynA after treated with different concentration of tunicamycin

采用SDS-PAGE分析诱导培养第8 d衣霉素添加对重组木聚糖酶表达的影响,结果如图7所示。泳道1～5均在45、35 kDa左右有条带,且条带逐渐变窄,当衣霉素添加量为5、10、15 μg/mL(即泳道3、4、5)时25～35 kDa的条带逐渐变亮,主条带变暗,经去糖基酶Endo H处理后可见在25 kDa左右出现条带,表明随着衣霉素添加量的增加,重组木聚糖酶N-糖基化的程度逐渐降低,但并未完全去除,接近编码该木聚糖酶基因推测的结果24.0 kDa。这可能是因为毕赤酵母分泌的蛋白大多数为N-连接糖基化高甘露糖型,蛋白转录后会一定程度上增加寡糖链长度。而增加的长度约为平均每个支链8～14个甘露糖残基,即去N-糖基化修饰后分子量约降低1～3 kDa[24]。由于N-糖基化动态的发生在内质网和高尔基体,蛋白质逐渐折叠成熟,这个过程中受到N-糖基化抑制剂衣霉素的影响,不仅添加糖链的大小不同,而且还会影响到糖链添加到蛋白质上的位置,已有报道称N-糖基化发生的程度不仅和糖链大小有关还与连接位置有密切关系,并且对蛋白质的功能结构及活性带来影响[9,25]。

图7 添加不同浓度衣霉素的XynA粗酶液的电泳图Fig.7 SDS-PAGE of rude XynA treated with different concentration of tunicamycin

如图8所示,经过对粗酶液进行PAS糖染色分析,糖原染色后糖基化蛋白呈现紫红色条带,可看出添加不同浓度衣霉素对木聚糖酶N-糖基化的抑制程度不同,随着衣霉素添加量的增加重组木聚糖酶的抑制程度越高,位于45 kDa的主条带紫红色变浅,而低于45 kDa的紫红色条带逐渐增多,但是衣霉素的添加并不能完全抑制糖链连接到蛋白上以至存在不同程度的N-糖基化。

图8 添加不同浓度衣霉素的XynA粗酶液的糖染色电泳图Fig.8 PAS of rude XynA treated with different concentration of tunicamycin注:M为低分子质量蛋白质Marker;泳道1～5：GS115/ pPIC9K-xynA衣霉素添加量分别为0、2、5、10、15 μg/mL。

2.4 抑制糖基化前后木聚糖酶酶学特性分析

2.4.1 pH对重组木聚糖酶活力的影响 由图9可知,GS115/pPIC9K-xynA最适反应pH为5.0,于pH3.5～5.0之间可保持40%以上的相对酶活力,在pH7.5～10.0时相对酶活不足10%,本实验木聚糖酶基因来源于枝链霉菌L2001,天然菌株表达两种分子量的木聚糖酶XynA和XynB,其中木聚糖酶XynA木聚糖酶在偏酸性的pH下(即pH5.0～7.0)比较稳定,相对酶活力都保持在60%以上[26],综上结果,重组木聚糖酶GS115/pPIC9K-xynA并不适合碱性环境;而添加不同浓度衣霉素的木聚糖酶最适反应pH并未发生改变仍为5.0,酶的最适pH受到蛋白质微环境以及氨基酸相互作用的多重影响[27],衣霉素抑制N-糖基化可能并没有引起木聚糖酶催化残基pKa值的改变，因此最适pH并没有发生改变;但其相对酶活力在pH2.0～5.0之间随着衣霉素添加量的增加而有所降低,这可能是由于抑制N-糖基化后木聚糖酶的酶活力降低而引起的。

图9 不同浓度衣霉素对XynA最适pH的影响Fig.9 The optimal pH of XynA treated with different concentration of tunicamycin

由图10可知,添加不同浓度衣霉素的重组木聚糖酶在pH2.5～10.0范围内相对酶活力均能保留50%及以上,具有较好的稳定性;由于不同缓冲体系的缓冲能力有一定的范围,同一pH不同缓冲体系的缓冲能力不同,对木聚糖酶的酶活力和稳定性产生了一定的影响。因此,N-糖基化对重组木聚糖酶XynA在不同pH下的活力和蛋白稳定性无明显影响。

图10 不同浓度衣霉素对XynA pH耐受力的影响Fig.10 Tolerance of XynA under different pH buffers from 2.0 to 10.0 treated with different concentration of tunicamycin

2.4.2 温度对重组木聚糖酶活力的影响 由图11可知,XynA的最适反应温度为65 ℃,并且在50～75 ℃间可保持50%以上的相对酶活力,经测定XynA在最适反应温度65 ℃时酶活为406.6 U/mL;添加不同浓度的衣霉素时,重组木聚糖酶最适反应温度均下降为60 ℃,与未添加组相比,添加衣霉素的木聚糖酶最适反应温度和比酶活均有所降低,且随着添加量的增加下降更加明显。这一结果表明N-糖链的修饰作用对木聚糖酶的空间结构产生了一定的影响,进而影响了酶分子对温度的耐受性。王茜[11]通过脱糖基化酶Endo H去除重组植酸酶phy(QF)的糖链,发现糖基化的植酸酶与未糖基化的植酸酶相比最适温度提高了5 ℃,Tm值提升2 ℃。因此,N-糖基化对XynA在不同温度下的活力有明显影响。

图11 不同浓度衣霉素对XynA最适温度的影响Fig.11 The optimal temperature of XynA treated with different concentration of tunicamycin

2.4.3 重组木聚糖酶的热稳定性 由图12可知,在低于55 ℃时,重组木聚糖酶XynA的相对酶活可以保持在35%以上,但随着温度的增加,稳定性逐渐降低,在65～75 ℃时,重组木聚糖酶XynA的相对酶活力不足5%,在80 ℃以上则可保留10%左右,而且衣霉素的添加也会降低酶的温度稳定性,但并不明显。Guo[12]研究发现毕赤酵母重组肌醇六磷酸酶在90 ℃处理10 min可维持40%的酶活,而去糖基化后在40 ℃处理10 min酶活剧烈下降。柯涛[28]等在Pichia pastoris GS115中表达嗜热酸性α-淀粉酶BD5088,发现糖基化修饰后的酶在100 ℃条件下热处理1 h仍具有80%以上的酶活力、最适反应温度由80 ℃增加到90 ℃。Guo[29]等发现N-糖基化可增加抗胰蛋白对于热的稳定性。

图12 不同浓度衣霉素对XynA耐热稳定性的影响Fig.12 Thermal stability of XynA treated with different concentration of tunicamycin

2.4.4 离子浓度及螯合剂对木聚糖酶活性的影响 如图13所示,金属离子Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+对重组木聚糖酶XynA有一定的激活作用;Cu2+及螯合剂EDTA对酶具有一定的抑制作用,其中Cu2+影响最明显,酶活仅残留23%;添加不同浓度衣霉素的重组木聚糖酶则表现出与未添加不同的结果,Na+、K+、Li+、Ca2+、Al3+、EDTA同样具有一定激活作用,但并未随着衣霉素浓度的增加而逐渐增强,Ba2+则表现出一定抑制作用,且随着衣霉素浓度的升高而逐渐降低。推测是因为基于酶蛋白的二级、三级结构,多肽的折叠缠绕肽链中的氨基酸残基的一定侧链就以一定的几何形式配置在金属离子周围,由于暴露的氨基酸残基数目和位置不同,所以与金属离子的结合形式也不同,衣霉素的添加会导致酶在内质网及高尔基体中翻译后折叠过程中糖链不能很好地结合在Asn残基上,从而对酶的分子结构产生了影响,导致酶与离子结合部位的几何形式发生变化,最终导致酶分子耐受离子能力改变[30]。

图13 不同浓度衣霉素对XynA 耐受金属离子及EDTA的影响Fig.13 Tolerance of XynA under different metal ions and EDTA treated with different concentration of tunicamycin

2.4.5 胃蛋白酶和胰蛋白酶对木聚糖酶活力的影响 由图14所示,重组木聚糖酶XynA对胰蛋白酶和胃蛋白酶的耐受力有所不同,对胰蛋白的耐受力要好于胃蛋白酶,衣霉素添加量为0、2、5、10 μg/mL时胰蛋白酶对酶活力影响较小,而添加量为15 μg/mL时,酶活损失24%;而胃蛋白酶对木聚糖酶活力的抑制随着衣霉素添加量的增加而减小,当添加量为5、10、15 μg/mL时剩余酶活力分别为64%、63%、64%,基本无明显差异,仍能保留50%以上。蛋白质表面的糖链还可覆盖蛋白质分子中的某些蛋白酶降解位点,从而增加蛋白质对于蛋白酶的抗性[31],同时还可以防止蛋白质的相互聚集[32]。

图14 不同浓度衣霉素对XynA 耐受胃蛋白酶及胰蛋白酶的影响Fig.14 Tolerance of XynA under Pepsin and Trypsin treated with different concentration of tunicamycin

3 结论

本实验通过在毕赤酵母诱导表达阶段添加不同浓度N-糖基化抑制剂——衣霉素,来考察N-糖基化对木聚糖酶分泌表达、酶学特性的影响。经不同浓度衣霉素的作用,对菌株毕赤酵母的生长基本无影响,但随着衣霉素添加量的增加木聚糖酶酶活力逐渐降低,主条带逐渐变浅,说明N-糖基化修饰对木聚糖酶正确折叠分泌表达有着重要的作用;衣霉素的添加并未对最适反应pH和pH稳定性产生影响,最适反应pH为5.0,于pH3.5～5.0之间可保持40%以上的相对酶活力;而最适反应温度在衣霉素添加量大于2 μg/mL时下降了5 ℃,且温度稳定性也有所下降;较未添加衣霉素组,不同浓度衣霉素添加组中Na+、K+、Li+、Ca2+、Al3+、EDTA具有一定激活作用,Ba2+具有抑制作用;衣霉素的添加抑制了木聚糖酶上N-糖链的正常附着,抗蛋白酶水解的能力有所下降。以上结果表明,N-糖基化修饰有利于提高木聚糖酶XynA的分泌表达量,且对酶的热稳定性有积极作用。

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