芹菜素介导Caveolin-1对脑缺血大鼠认知功能的改善作用

涂丰霞 张惠梅 谢庆凤 庞琼怡 陈翔

脑卒中患者常遗留认知功能障碍，主要表现为学习记忆功能缺损。在谷氨酸受体中，N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate acid,NMDA）受体与学习记忆的关系最为密切。N-甲基-D-天门冬氨酸受体亚单位2B（N-methyl-D-aspartate receptor 2B，NR2B）是 NMDA受体中主要的功能亚单位，在学习和记忆的调控中起重要作用[1]。研究发现小凹蛋白1（Caveolin-1）能影响谷氨酸受体通道从而增强突触的传递效率，并改善树突棘的形态结构和促进新棘的形成，进而促进长时程增强，起到改善认知及学习记忆能力的作用[2-3]。芹菜素属于黄酮类化合物，研究表明其具有改善认知和记忆功能的作用[4-5]，但其具体机制仍有待进一步探明。本研究观察芹菜素对脑缺血后大鼠认知功能的改善作用及对Caveolin-1及NR2B表达的影响，探讨其改善脑缺血大鼠认知功能的相关机制，现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂

1.1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠32只，3～4月龄，体重（250±20）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，饲养于湿度 60%、室温（25±1）℃的环境下，大鼠自由饮食及活动。

1.1.2 主要试剂 芹菜素（≥99%纯度）购自陕西慧科植物开发有限公司。先用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）配成母液待用，使用时用0.9%氯化钠溶液配成浓度 11.6×10-3mol/L 溶液。Caveolin-1（ab2910）、NR2B（ab65783）抗体购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制作及分组 参照Belayev等[6]报道的线栓法加以改良后建立大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）再灌注模型。大鼠以左侧为栓塞侧，用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉，颈部剃毛，常规消毒后，切开正中皮肤及浅筋膜，分离出左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉及其分支，结扎颈外动脉及其分支，用血管剪在颈外动脉近分叉处剪一细小切口，小心插入栓线，把已结扎的颈外动脉及其分支剪断，轻轻牵拉颈外动脉，使其与颈内动脉成一直线，栓线绕过颈总动脉分叉，进入颈内动脉往颅内方向推进，微遇阻力后停止，插入深度约18～22mm，表明此时大脑中动脉血流已被阻断。大鼠脑缺血1.5h时，在麻醉状态下拔除栓线，即可实现大脑中动脉再灌注。造模后将大鼠置于清洁的鼠笼内，自由饮食、饮水及活动。假手术组操作步骤同上，剥离颈动脉后随即缝合创口。大鼠按随机数字表法分为4组：假手术组、模型组、低剂量芹菜素干预组（低芹菜素组）及高剂量芹菜素干预组（高芹菜素组），每组8只。低、高芹菜素组于造模同时分别腹腔注射芹菜素溶液20mg/kg或40mg/kg，之后1次/d，连续28d。假手术组和模型组于相同时间腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。4组大鼠均在造模后前3d腹腔注射8 000U庆大霉素预防感染。造模后第28天处死大鼠，留取缺血侧海马组织，进行相关指标检测。

1.2.2 行为学评估 （1）神经行为学评分：造模后1d进行。按照Zea Longa[7]5分制评分标准，0分：没有神经功能缺损；1分：不能完全伸展对侧前肢；2分：行走时向偏瘫侧转圈；3分：行走时向偏瘫侧倾倒；4分：意识障碍，不能自发行走；5分：死亡。术后评分1至3分即为造模成功，进行后续实验。（2）水迷宫测试：①定位航行实验：给药第23～27天，每天上午将4组大鼠从某一特定象限面向池壁入水，记录90s内大鼠寻找并爬上平台的时长（逃避潜伏期），以此作为学习记忆能力的指标。若实验动物90s内未找到平台，则引导其站上平台并停留10s，并将其逃避潜伏期计为90s。②空间探索实验：第27天下午，将平台撤除，将动物由位于原先平台象限的对侧边放入水中。记录动物在目标象限（原先放置平台的象限）所花的时间（空间探索时间）以此反映大鼠对平台所在位置的记忆能力。

1.2.3 脑组织病理改变 脑组织石蜡切片脱蜡至水，HE染色，观察脑组织病理改变。

1.2.4 检测Caveolin-1和NR2B mRNA表达水平 （1）采用RT-qPCR法检测Caveolin-1和NR2B mRNA表达：Trizol试剂盒提取总RNA。反转录反应体系的配置：2×RT buffer（10μl），6N 随机引物（1μl）、RT-mix（1μl）、模板 RNA（5μl）、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate,DEPC）水（3μl）；反转录条件设置：25℃10min，42℃50min，85℃ 5min。定量PCR反应体系的配置：2×PCR buffer（25μl）、Primers（1μl×2）、Sybr green I（0.5μl）、模板 cDNA（2μl）、DEPC 水（20.5μl）；扩增条件的设置：94℃ 4min，94℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 30s，循环 35 次，72℃检测信号。（2）采用Western blot法检测Caveolin-1蛋白表达：常规蛋白提取、电泳、转膜、封闭，一抗为1∶500稀释兔抗鼠单克隆抗体，1∶1 000用二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶标记，显色、显影、定影、摄像。Bandscan软件条带分析，计算灰度值。以内参条带甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,gapdh）和目的条带的积分光密度值之比作为反映目的蛋白的表达水平。（3）采用免疫组化法检测NR2B表达部位及蛋白表达量：脑组织石蜡切片脱蜡至水，抗体修复，封闭，一抗（1∶100）4℃孵育过夜，生物素标记羊抗鼠IgG孵育，37℃恒温60min，加显色剂 3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐（3，3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate,DAB）显示。苏木素复染核1min，脱水，透明，封片。空白对照片一抗用0.01mol代替。每只大鼠任取1张免疫组化切片，在统一放大倍数（×400）下，于脑缺血侧海马区随机选取5个视野摄片后，用美国IPP 6.0分析软件进行图像分析，测定阳性细胞吸光度值（OD）值。

1.3 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件，计数资料以±s表示。所有数据进行正态性检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐者用LSD-t检验，方差不齐者用Dunnett′T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠逃避潜伏期及空间探索时间比较见表1。

表1 4组大鼠逃避潜伏期及空间探索时间比较（s）

由表1可见，模型组大鼠第26天、第27天逃避潜伏期均大于假手术组，差异均有统计学意义（t=2.138、3.001，均P＜0.05）。高芹菜素组大鼠第26天逃避潜伏期小于模型组，差异有统计学意义（t=2.521，P＜0.05）。高、低芹菜素组大鼠第27天逃避潜伏期均小于模型组，差异均有统计学意义（t=2.193、2.283，均P＜0.05）。模型组大鼠空间探索时间小于假手术组，差异有统计学意义（t=2.789，P＜0.01）；高、低芹菜素组大鼠空间探索时间均大于模型组，差异均有统计学意义（t=2.368、2.060，均 P＜0.05）。

2.2 4组大鼠脑缺血侧海马组织病理改变见图1。

图1 4组大鼠脑缺血侧海马组织病理改变（a：假手术组；b：模型组；c：低芹菜素组；d：高芹菜素组；HE染色，×400）

由图1可见，假手术组海马神经元排列整齐，细胞形态学和大小正常。模型组大鼠海马神经元排列松散，细胞体固缩，部分核固缩、核断裂、核溶解甚至消失。芹菜素干预组大鼠海马神经元损伤较模型组轻。

2.3 4组大鼠脑缺血侧海马组织Caveolin-1和NR2B表达水平比较见表2。

由表2可见，高、低芹菜素组Caveolin-1 mRNA表达均高于假手术组，差异均有统计学意义（t=2.724、2.371，均P＜0.05）。高芹菜素组Caveolin-1 mRNA表达高于模型组，差异有统计学意义（t=2.321，P＜0.05）。模型组、高、低芹菜素组Caveolin-1蛋白表达均高于假手术组，差异均有统计学意义（t=2.582、5.135、2.697，均 P＜0.05）。高芹菜素组Caveolin-1蛋白表达高于模型组与低芹菜素组，差异均有统计学意义（t=2.553、2.438，均P＜0.05）。高、低芹菜素组NR2B mRNA表达高于模型组，差异均有统计学意义（t=2.785、2.572，均 P＜0.05）。模型组NR2B蛋白表达低于假手术组，差异均有统计学意义（t=2.182，P＜0.05）。高、低芹菜素组NR2B蛋白表达均高于模型组，差异均有统计学意义（t=3.016、2.870，均P＜0.05）。Caveolin-1蛋白表达的Western blot条带见图2。免疫组化结果显示NR2B蛋白主要在胞质胞膜表达见图3。

表2 4组大鼠脑缺血侧海马组织Caveolin-1和NR2B表达水平比较

图2 4组大鼠脑缺血侧海马组织Caveolin-1蛋白表达电泳图

图3 4组大鼠脑缺血侧海马组织NR2B蛋白表达（a：假手术组；b：模型组；c：低芹菜素组；d：高芹菜素组，均为免疫组化，×400，箭头所示为NR2B染色阳性颗粒，主要在胞质胞膜表达）

3 讨论

认知功能是人脑的一个重要功能，超过75%的脑卒中患者可能遗留认知功能障碍，包括记忆力、定向力、注意力等的缺陷，严重影响他们的生活质量。芹菜素是一种天然植物，具有神经保护作用。有报道芹菜素可以降低Aβ含量，缓解阿尔茨海默病的认知和记忆损害[4]。我们前期研究亦发现芹菜素可以通过抑制组蛋白去乙酰化酶活性，调节组蛋白乙酰化，诱导脑源性神经生长因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）和突触蛋白 I（synapsin I，Syn-I）表达，起到改善脑卒中后认知功能障碍的作用[5]。本研究结果显示，芹菜素改善脑卒中后认知功能障碍可能与调控Caveolin-1、NR2B表达有关。

脑缺血再灌注损伤后会产生明显的认知和记忆障碍。我们实验结果显示，模型组大鼠寻找隐蔽平台的时间较假手术组延长，说明造模后大鼠的空间记忆能力下降。芹菜素组比模型组的空间定位和记忆功能均明显有改善。为了评估最小的有效芹菜素剂量，我们用了两个不同剂量的芹菜素来干预。空间探索实验证明，不同剂量芹菜素组的空间探索时间较模型组明显增加，且两剂量组间差异无统计学意义。低芹菜素组在第26天时寻找隐蔽平台时间与模型组比较无明显差异，高芹菜素组在第26天即出现寻找隐蔽平台时间较模型组缩短，提示高剂量芹菜素改善脑缺血大鼠认知记忆作用可能优于低剂量芹菜素，可加大样本量做进一步的研究。

Caveolin-1是一种转膜清道夫蛋白，被发现存在于膜脂质筏，在中枢神经系统的神经元内表达丰富。有实验表明，Y-迷宫学习训练后大鼠皮层内Caveolin-1表达升高，提示Caveolin-1在分辨学习记忆过程中起作用[8]。Caveolin-1与脑功能的生理和病理变化有关，它影响神经发育、突触可塑性等过程[9]。神经元过表达Caveolin-1增加神经膜/脂质筏功能，Caveolin-1定位在海马神经元的生长锥体和树突，促进神经元的分化和成熟[10]，促进海马依赖的学习和记忆功能的改善[11-12]。另外，Caveolin-1表达增加，促进突触前蛋白和突触后蛋白表达增加，在突触可塑性中起重要的作用。我们的结果显示脑缺血后Caveolin-1表达升高，与以往的报道一致[13-14]。但是本研究结果与Shen等[15]研究结果不一致，他们的研究显示在脑缺血再灌注早期随着一氧化氮产生的增多会抑制Caveolin-1表达，考虑可能与模型缺血再灌注时间差异及实验方案的不同等有关。芹菜素干预能促进Caveolin-1表达，同时大鼠记忆认知功能明显有改善，主要是高剂量芹菜素起作用，而低剂量芹菜素作用不明显。

NMDA受体是中枢神经系统中一类重要的兴奋性氨基酸受体，可调节神经元的存活、树突和轴突的结构发育、突触的可塑性及突触重排等，对神经回路的形成及学习记忆过程起促进作用。NR2B是NMDA受体的主要调节亚单位，在脑缺血的发生、发展中发挥很重要的作用。急性脑缺血时NR2B亚基表达增加或功能增强会加重缺血性脑损伤的兴奋毒性损害，而慢性脑缺血后期其表达下调可能与血管性痴呆患者的认知功能障碍有关。NR2B不仅参与学习、记忆、介导缺血性脑损伤，而且是突触可塑性、皮质和海马神经元长时程增强效应的主要调控者[16-17]。Nakamori等[18]发现，在大鼠学习记忆训练后，学习记忆主要区域NR2B蛋白表达升高。本研究结果显示脑缺血后期缺血侧海马脑组织NR2B表达下调，伴随大鼠记忆认知功能障碍，而芹菜素能够增加NR2B的表达，与认知功能的改善相关。

我们的研究结果显示，芹菜素能促进Caveolin-1表达，增加NR2B分泌，明显改善脑缺血大鼠记忆认知功能。但是低剂量芹菜素提高Caveolin-1的作用不明显，考虑芹菜素除了调控Caveolin-1表达外，尚通过调控其它因子表达，来改善脑缺血后大鼠认知功能的作用。我们的结果部分解释了芹菜素对脑缺血大鼠认知功能障碍的改善作用及机制。然而，其潜在的作用机制仍有待进一步的探讨。

[1]Doguc DK, Delibas N, Vural H, et al. Effects of chronic scopolamine administration on spatial workingmemory and hippocampal receptors related to learning [J]. Behav Pharmacol, 2012, 23: 762-770. doi:10.1097/FBP.0b013332835a38af.

[2]Francesconi A,Kumari R,Zukin RS.Regulation of group I metabotropic glutamate receptor trafficking and signaling by the caveolar/lipid raft pathway[J].J Neurosci,2009,29(11):3590-3602.doi:10.1523/JNEUROSCI.5824-08.2009.

[3]Brian P.Head,Hemal H.Patel,Yasuo M.Tsutsumi,et al.Caveolin-1 expression is essential for N-methyl-d-aspartate receptor-mediated Src and extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation and protection of primaryneurons from ischemic cell death[J].FASEB J,2008,22(3):828-840.doi:10.1096/fj.07-9299com.

[4]Morris MJ,Mahgoub M,Na ES,et al.Loss of histone deacetylase 2 improves working memory and accelerates extinction learning[J].J Neurosci,2013,33 (15): 6401-6411.doi: 10.1523/JNEUROSCI.1001-12.2013.

[5]Tu F,Pang Q,Huang T,et al.Apigenin ameliarates post-stroke cognitive deficits in rats through histone acetylation-mediated neurochemical alterations[J].Med Sci Monit,2017,23:4004-4013.doi:10.12659/MSM.902770.

[6]Belayev L,Alonso OF,Busto R,et al.Middle cerebral artery occluxion in the rat by intraluminal suture:neurological and pathological evaluation of animprovedmode[J].Stroke,1996,27:1616-1623.doi:https://doi.org/10.1161/01.STR.27.9.1616.

[7]Zea Longa EL,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.doi:https://doiorg/10.1161/01.STR.20.1.84.

[8]连永亮,邹萍,马依妮,等.小鼠皮层caveolin-1蛋白表达与作业成绩的相关性[J].中华行为医学与脑科学杂志,2011,20(10):872-874.doi:10.3760/cma.j.issn.1674-6554.2011.10.003.

[9]Takayasu Y,Takeuchi K,Kumari R,et al.Caveolin-1 knockout mice exhibit impaired induction of mGluR-dependent long-term depression at CA3-CA1 synapses[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(50):21778-21783.doi:10.1073/pnas.1015553107.

[10]Li Y,Lau WM,So KF,et al.Caveolin-1 inhibits oligodendroglial diffrentiation of neural stem/progenitor cells through modulating β-catenin expression[J].Neurochem Int,2011,59(2):114-121.doi:10.1016/j.neuint.2011.05.019.

[11]Head BP,Hu Y,Finley JC,et al.Neuron-targeted caveolin-1 protein enhances signaling and promotes arborization of primaryneurons[J].J BiolChem,2011,286 (38):33310-33321.doi:10.1074/jbc.M111.255976.

[12]Mandyam CD,Schilling JM,Cui W,et al.Neuron-Targeted Caveolin-1 Improves Molecular Signaling,Plasticity,and Behavior Dependent on the Hippocampusin Adult and Aged Mice[J].BiolPsychiatry,2017,81(2):101-110.doi:10.1016/j.biopsych.2015.09.020.

[13]Gao Y,Zhao Y,Pan J,et al.Treadmill exercise promotes angiogenesis in the ischemic penumbra of rat brains through caveolin-1/VEGF signaling pathways[J].Brain Res,2014,1585:83-90.doi:10.1016/j.brainres.2014.08.032.

[14]Zhao Y,Pang Q,Liu M,et al.Treadmill exercise promotes neurogenesis in ischemic rat brains via caveolin-1/VEGF signaling pathways[J].Neurochem Res,2017,42(2):389-397.doi:10.1007/s11064-016-2081-z.

[15]Shen J,Ma S,Chan P,et al.Nitric oxide down-regulates caveolin-1 expression in rat brains during focal cerebral ischemia and reperfusion injury [J]. J Neurochem, 2006, 96 (4): 1078-1089. doi:10.1111/j.1471-4159.2005.03589.x.

[16]Chen Y,Chen AQ,Luo XQ,et al.Hippocampal NR2B-containing NMDA receptors enhance long-term potentiation in rats with chronic visceral pain[J].Brain Res,2014,1570:43-53.doi:10.1016/j.brainres.2014.05.001.

[17]Hasegawa Y,Mukai H,Asashima M,et al.Acute modulation of synaptic plasticity of pyramidal neurons by activin in adult hippocampus[J].Front Neural Circuits,2014,8:56.doi:10.3389/fncir.2014.00056.

[18]Nakamori T,Sato K,Kinoshita M,et al.Positive feedback ofNR2B-containing NMDA receptor activity is the initial step toward visual imprinting:a model for juvenile learning[J].J Neurochem,2015,132(1):110-123.doi:10.1111/jnc.12954.