克癀胶囊体外抑菌作用的研究

马鸿杰 毛新 邓若娟 刘传灵 傅月亮

克癀由三七、黄连、黄芩、黄柏、大黄、白花蛇舌草、山银花、人工牛黄、皂角刺、人工麝香、石菖蒲、甘草等十六味中药组成, 经生物发酵等工艺加工制成胶囊, 具有清热解毒、化瘀散结、活血利湿、利胆退黄等功效。其中三七为方中君药, 有文献报道［1］, 黄连、牛黄、黄芩、麝香、石菖蒲、甘草均能不同程度的抑制细菌生长, 黄连对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强；金银花对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有不同程度的抑制作用［2］；牛黄解毒片对急性渗出性炎症有明显抑制作用, 对耐药金黄色葡萄球菌等有明显抑制作用、对绿脓杆菌等无明显影响［3］；马万霞等［4］以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌进行体外抑菌试验,结果表明5种中药提取液对4种菌的抑菌效果明显［5-7］。克癀胶囊是应用中药发酵工艺并投入生产的为数不多的几个品种之一, 发酵中药所包含的成分极其复杂, 对其成分分离纯化有较大的难度, 本文为了更加客观科学的描述克癀胶囊的应用功能, 采用了牛津杯法以及药敏纸片法体外实验的方式进一步验证了克癀胶囊对细菌的抑制作用。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 菌种 金黄色葡萄球菌：国家微生物资源平台,第3代；白色念珠菌：国家微生物资源平台, 第2代；大肠埃希菌：中国食品药品检定研究院第, 第2代；铜绿假单胞菌：中国食品药品检定研究院, 第2代。

1. 1. 2 药物 克癀胶囊(深圳同安药业有限公司, 0.4 g/粒)；京制牛黄解毒片(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂,0.6 g/片)；蒲地蓝消炎胶囊(广东心宝药业科技有限公司,0.4 g/粒)；氨苄西林(中国食品药品检定研究院, 规格10 μg/ml)。上述药品按照2015年版《中国药典》鉴定合格。

1. 1. 3 试剂与仪器 MH琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司)；MH肉汤培养基(广东环凯微生物科技有限公司)；TSA平板(上海诺狄微生物科技有限公司)；3 ml 0.85%NaCl培养基(bioMerieux sa)；pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(广东环凯微生物科技有限公司)；双圈定量滤纸(中速)；立式高压灭菌锅；生物安全柜；生化培养箱；烘箱；打孔机；电子比浊仪。

1. 2 方法

1. 2. 1 药液的制备 克黄胶囊抑菌作用初筛试验浓度：无菌取克癀胶囊16粒, 溶于25 ml pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中, 浸泡1～2 h, 4000 r/min, 离心30 min后, 无菌取上清液, 浓度为0.256 g/ml；氨苄西林对照品10 μg/ml, 用0.01 mol/L盐酸、磷酸盐缓冲液稀释成1 μg/ml为阳性对照；pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为阴性对照。

克癀胶囊、蒲地蓝消炎胶囊、京制牛黄解毒片药液对金黄色葡萄球菌抑菌效果对比初筛试验浓度：分别无菌取克癀胶囊8粒、5片京制牛黄解毒片、6粒蒲地蓝消炎胶囊溶于10 ml pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中, 浸泡1～2 h,4000 r/min, 离心30 min后, 无菌取上清液, 浓度分别为0.32、0.30、0.24 g/ml。用pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液分别对三种药液进行倍比稀释, 浓度分别为0.32、0.16、0.08 g/ml, 0.30、0.15、0.075 g/ml, 0.24、0.12、0.06 g/ml。

药敏纸片法抑菌试验浓度：上述方法制备克癀胶囊浓度分别为0.40、0.20、0.10、0.05 g/ml；蒲地蓝胶囊浓度为浓度为0.32、0.16、0.08、0.04 g/ml；京制牛黄解毒片药液浓度分别为 0.50、0.25、0.125、0.0625 g/ml。

1. 2. 2 菌悬液的制备 将受试菌种金黄色葡萄球菌(或大肠埃希菌或铜绿假单胞菌或白色念珠菌)接种至9 cm TSA平板 , 于 30～35℃培养 16～18 h ；取 3 ml 0.85%NaCl培养基 , 用无菌棉签挑取数个单菌落, 研磨均匀, 滴管反复吹打均匀,用电子比浊仪测量麦氏浓度, 取0.6、0.8、0.7、2.1 MCF浓度的菌悬液, 用平皿计数得出107cfu/ml菌悬液对应的麦氏浓度。

1. 2. 3 测定平板的制备 取直径约9 cm的平皿, 倒入20～25 ml温度＜45℃灭菌的MH琼脂培养基, 铺制约4 mm厚的测定板底层, 冷却凝固后, 用无菌棉拭蘸取107个/ml(对应的麦氏浓度)的菌液(金黄色葡萄球菌或大肠埃希菌或铜绿假单胞菌或白色念珠菌), 在管内壁液面上方旋转紧压,将多余菌液挤去, 然后在MH琼脂培养基表面均匀涂布接种2次, 每次旋转平板60°以确保接种菌的均匀分布, 最后沿平板内缘涂抹1周。接种好的平板, 可敞开盖子在室温下干燥 3～5 min。

1. 2. 4 药敏纸片扩散法 用打孔机将10张双圈定量滤纸(中速)打出直径7 mm空白纸片, 置于玻璃平皿中, 用灭菌袋封好, 121℃灭菌30 min, 取出放置 37℃干燥箱烘干。用镊子夹取已灭菌纸片, 在每个接种的MH琼脂培养基平板中贴4个灭菌纸片, 纸片间隔、纸片与培养基边缘的距离应≥2 cm。

2 结果

2. 1 初筛试验(牛津杯法)

2. 1. 1 克癀胶囊抑菌作用 在生物安全柜中, 将4个牛津杯均匀放置在4种菌测定平板上, 牛津杯间隔距离应≥2 cm,其中2个牛津杯分别加入200 μl浓度0.256 g/ml的克癀胶囊药液、1个加入200 μl含1 μg/ml的氨苄西林对照品、1个加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液200 μl作为阴性对照。置陶瓦盖内于37℃生化培养箱中培养24 h, 观察并测量抑菌圈直径的大小(抑菌圈越大说明其抑菌作用越强)。克癀胶囊对金黄色葡萄球菌有一定抑菌效果, 但低于氨苄西林, 对大肠埃希菌或铜绿假单胞菌或白色念珠菌无抑菌作用。见表1。

2. 1. 2 克癀胶囊、蒲地蓝消炎胶囊、京制牛黄解毒片药液对金黄色葡萄球菌抑菌效果初步对比 在牛津杯中分别加入3个不同浓度的克癀胶囊药液、蒲地蓝胶囊药液、京制牛黄解毒片药液和pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(阴性对照)各200 μl。37℃生化培养箱中培养24 h后, 观察各浓度药液对金黄色葡萄球菌的抑菌性, 测量抑菌圈直径的大小。克癀胶囊药液的浓度对金黄色葡萄球菌抑制有关, 即药液浓度越高,抑菌能力越强。见表2。

表1 克癀胶囊药液对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌的抑菌初筛结果(cm)

表2 不同浓度的克癀胶囊、蒲地蓝消炎胶囊、京制牛黄解毒片对金黄色葡萄球菌的抑菌性结果(cm)

2. 2 克癀胶囊对金黄色葡萄球菌的MIC值测定

2. 2. 1 药敏纸片扩散法 平皿1分别加入80 μl的0.16g/ml蒲地蓝消炎胶囊药液、0.40 g/ml克癀胶囊药液、0.20 g/ml克癀胶囊药液、pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(阴性对照)；平皿2分别加入80 μl的0.16 g/ml蒲地蓝消炎胶囊药液、0.20 g/ml克癀胶囊药；0.10 g/ml克癀胶囊药液、pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(阴性对照)。将测定平皿于37℃生化培养箱中培养24 h后, 观察并测量抑菌圈直径的大小。克癀胶囊对金黄色葡萄球菌的MIC为0.10～0.20 g/ml。见表3。

2. 2. 2 微量肉汤稀释法 (96孔板法)0.80 g/ml的克癀胶囊药液, 用移液枪无菌吸取 100 μl, 注入 96孔细胞培养板, 平行2个孔, 然后加入MH肉汤培养基做连续4次对倍稀释, 得出0.40、0.20、0.10、0.05 g/ml的克癀胶囊药液；制作0.32 g/ml浓度的蒲地蓝消炎胶囊药液作为起始浓度, 同法稀释得出0.32、0.16、0.08、0.04 g/ml的蒲地蓝胶囊药液作为对照；将以上药液孔加入含菌量≤100 cfu的金黄色葡萄球菌20 μl/孔,用20 μl菌液代替药液、加入100 μl MH培养基作为阳性对照, 20 μl MH培养基加入100 μl MH培养基作为阴性对照。置37℃生化培养箱中培养24 h后, 置于显微镜下观察是否有菌生长, 每孔分别取30 μl 培养物用 TSA平板上涂布, 于30～35℃生化培养箱培养24～48 h, 观察是否有菌生长。克癀胶囊对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.10～0.20 g/ml。见表4。

表3 不同浓度的克癀胶囊对金黄色葡萄球菌的抑菌作用(cm)

表4 微量肉汤稀释法对克癀胶囊对金黄色葡萄球菌的MIC值的测定

3 讨论

抗生素的应用使人类许多严重的细菌感染性疾病得到有效控制。然而由于抗生素的不合理使用导致了大量耐药性细菌的出现, 降低了现有抗生素的应用效率, 耐药性细菌感染严重地威胁着人类的健康［8,9］。研究和开发抗菌中药对解决耐药菌株的产生和抗生素短缺问题具有重要意义, 传统中药对常见病原细菌具有一定的抑制作用。但不同中药对不同细菌表现不同的抑菌作用［10,11］。

实验结果表明, 克癀胶囊药液的浓度对金黄色葡萄球菌抑制有关, 即药液浓度越高, 抑菌能力越强, 其对金黄色葡萄球菌的MIC为0.10～0.20 g/ml。而克癀胶囊对大肠埃希菌或铜绿假单胞菌或白色念珠菌无抑菌作用。通过研究可以看到, 克癀胶囊的对金黄色葡萄球菌的抑菌作用较强, 且随着浓度的提高, 其抑菌能力越强。而另外2种药物对金黄色葡萄球菌的的体外抑制作用较弱。目前, 金黄色葡萄球菌耐药性问题是临床治疗中面临的一大难题。大量研究报道也指出,黄连对耐甲氧西林的葡萄球菌具有一定的抑菌作用［12,13］, 克癀胶囊成分较为复杂, 如果能够进一步对克癀胶囊的抑菌机理进行阐述, 将有助于在金葡菌感染中尝试应用中药克簧进行治疗。在传统中药中进行抗菌药物的发掘, 将有助于发挥传统中药在临床抗感染中的应用, 本研究将为克癀胶囊的临床应用提供科学的的实验数据。

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