痤疮散微生物限度检查方法的适用性试验研究

2018-08-16 07:11简晓莉刘志承李曙光刘纪青
中国药业 2018年16期
关键词:平皿试液稀释液

简晓莉,刘志承,李曙光,刘纪青

(广东省深圳市中医院,广东 深圳 518033)

痤疮散为我院临床应用20多年的院内制剂,有清热、祛风、杀虫等作用,主要用于治疗痤疮,外用疗效显著[1-3]。2015 年版《中国药典(四部)》的微生物限度检查法结合国情、参考欧美药典进行了修订,与2010年版《中国药典》的方法相比,在培养基、培养条件和检验方法上均有重大改进[4]。为了提高痤疮散的质量标准,确保医院制剂的用药安全,本研究中根据2015年版《中国药典(四部)》[5]微生物限度检查法中的相关规定,对痤疮散的微生物限度检查法进行重新修订,并进行了适用性试验。现报道如下。

1 仪器、试药与材料

1.1 仪器

TX323L型电子天平(日本岛津公司);LMQ.C型高压蒸汽灭菌器(山东博科生物产业有限公司);SPX-150BY-Ⅱ型生化培养箱(北京鑫腾达仪器设备有限公司);HH.B11.500-BY -Ⅱ型电热恒温培养箱(广州永程科学设备有限公司);电恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);1300 A2型生物安全柜(赛默飞世尔科技<中国>有限公司)。

1.2 试药

痤疮散(深圳市中医院院内制剂,批号分别为20160223,20160303,20160309);胰酪大豆胨琼脂培养基 (TSA,批号为 3105210),沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA,批号为3105268),胰酪大豆胨液体培养基(TSB,批号为3105171),沙氏葡萄糖液体培养基(SDB,批号为3105054),甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号为3105175),溴化十六烷基三甲琼脂培养基(批号为3105130),无菌氯化 -蛋白胨缓冲液(pH =7.0,批号为 3105256),均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 试验菌株

金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]菌种,均购自中国食品药品检定研究院,且均使用第3代培养物。

2 方法与结果

2.1 微生物计数法适用性试验

2.1.1 菌液制备

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌:取TSB新鲜培养液,稀释至不大于100 cfu/mL,备用。

白色念珠菌:取SDB新鲜培养液,稀释至不大于104cfu/mL 及不大于 100 cfu/mL,备用。

黑曲霉:取孢子悬液,稀释至不大于104cfu/mL及不大于100 cfu/mL,备用。

2.1.2 供试液制备

从2个(或以上)包装中取本品10 g,加稀释液至100 mL,45 ℃保温振摇使其分散均匀(pH =6.5),静置,取上清液,得1∶10供试液;取1∶10供试液,分别稀释成 1 ∶20,1 ∶50,1 ∶100的供试液。

2.1.3 供试液中微生物的回收

需氧菌总数(平皿倾注法):试验组取无菌试管5 支,分别加 2.1.2 项下制备的供试液各 9.9 mL 及2.1.1 项下制备的菌液各 0.1 mL,混匀,取 1 mL 置无菌平皿中,倾注TSA依法培养、计数,每株试验菌平行制备2个平皿。供试液对照组取无菌试管1支,以稀释液替代菌液,同试验组操作。菌液对照组取无菌试管5支,以稀释液替代供试液,同试验组操作。

需氧菌总数(薄膜过滤法):试验组取2.1.2项下制备的1∶20供试液的上清液1 mL,加至装有100 mL pH=7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液过滤器中(φ75 mm滤膜),混匀,滤尽,再按 300 mL/膜(冲洗 3次,每次100 mL)的冲洗量冲洗,在最后100 mL冲洗液中各加2.1.1 项下制备的菌液 1 mL(不大于 100 cfu /mL),取滤膜依法培养、计数。供试液对照组除不加菌外同试验组操作。菌液对照组以稀释液替代供试液,同试验组操作。

霉菌和酵母菌总数(平皿倾注法):试验组取无菌试管 2支,分别加 2.1.2项下制备的 1∶10,1∶20供试液9.9 mL及2.1.1项下制备的白色念珠菌及黑曲霉菌液各0.1 mL,混匀,取1 mL于无菌平皿中,倾注SDA依法培养、计数,每株试验菌平行制备两个平皿。供试液对照组取无菌试管1支,以稀释液替代菌液,同试验组操作。菌液对照组取无菌试管2支,以稀释液替代供试液,同试验组操作。

2.1.4 微生物回收率计算

微生物回收率=(试验组菌落数-供试液对照组菌落数)/菌液对照组菌落数×100%。结果见表1和表2。

表1 需氧菌总数计数适用性试验回收率(%)

表2 真菌和酵母菌总数计数适用性试验回收率(%)

2.2 控制菌检查法适用性试验

2.2.1 菌液制备

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌:取TSB新鲜培养液,稀释至不大于100 cfu/mL,备用。

2.2.2 金黄色葡萄球菌检查方法适用性试验

增菌培养:试验组取 100,200,500 mL TSB,加2.1.2项下制备的 1 ∶10供试液 10 mL 及 2.2.1 项下制备的金黄色葡萄球菌1 mL,混匀,依法培养18~24 h。供试液对照组以稀释液代替菌液,同试验组操作。阴性对照组以稀释液替代供试液及菌液,同试验组操作。

选择和分离培养:取增菌培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上,30~35℃培养18~72 h。

2.2.3 铜绿假单胞菌检查方法适用性试验

增菌培养:试验组取 100 mL TSB,加 2.1.2项下制备的1∶10供试液10 mL及2.2.1项下制备的铜绿假单胞菌1 mL,混匀,依法培养18~24 h。供试液对照组以稀释液代替菌液,同试验组操作。阴性对照组以稀释液替代供试液及菌液,同试验组操作。

选择和分离培养:取增菌培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上,30~35℃培养18~72 h。结果见表 3。

表3 金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌适用性试验结果

3 讨论

本品剂型为散剂,在需氧菌总数薄膜过滤法试验中,1∶10供试液上清液易吸入药品粉末,过滤困难,经纱布过滤仍难以改善,故取1∶20供试液进行薄膜过滤法方法适用性试验。

本品由大黄、黄连、白芷、防风等9味药组方,这些药物成分对微生物均有抑制作用[6-15]。3批样品的验证试验结果表明,本品对需氧菌中的枯草芽孢菌、白色念珠菌有抑制作用,对金黄色葡萄球菌有较强抑菌性。采用1∶100稀释级供试液进行平皿法试验,金黄色葡萄球菌几乎没有回收。采用薄膜过滤法,用300 mL pH=7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗即可消除其抑菌作用,回收率在2015年版《中国药典(四部)》附录规定的50%~200%之间,说明薄膜过滤法应用于本品需氧菌总数的微生物检查具有可行性。由表2可见,本品对霉菌及酵母菌总数中的白色念珠菌有微弱的抑菌性,采用1∶20供试液进行平皿法试验能消除其抑菌性,2种试验菌均在2015年版《中国药典(四部)》附录规定的50% ~200%之间,方法可行。控制菌方法验证试验结果表明,本品对金黄色葡萄球菌有较强抑制作用,加入100 mL及200 mL培养液,试验组仍无菌生长,需加培养液至500 mL才能消除其抑菌性。由表3可见,采用常规方法检查痤疮散中的铜绿假单胞菌,试验组为阳性,方法可行。本方法验证结果准确、可靠、重复性好,可用于痤疮散的微生物限度检查。

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