镇肝熄风汤对帕金森病大鼠模型纹状体氧化应激的影响

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帕金森病(Parkinson′s disease，PD) 是一种常见的中枢神经系统变性疾病，好发于中老年病人，临床上主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌僵直、姿势步态异常等[1]。属于中医学颤证、痉病、筋痹等范畴，随着人口老龄化的日趋明显，发病率逐年上升，临床上治疗主要针对帕金森病的发病机制为脑黑质 -纹状体内多巴胺减少，遂外源性补充左旋多巴制剂为主要治疗药物。但研究表明，帕金森病人长期应用左旋多巴制剂治疗会存在症状反复甚至加重，这都表明药物的效力减弱甚至失效，使病人产生耐药性，为控制症状，不得不加大药物使用剂量，且药物本身对人体会带来不同程度的副作用，致使病人的依从性差，帕金森症状难以控制。而中医学在控制帕金森病上发挥了一定的优势，因此本研究旨在观察中西医结合疗法对帕金森病的疗效。本课题小组近年来一直致力于临床研究帕金森病病人在使用左旋多巴基础上，加用镇肝熄风汤加减，使帕金森病病人得到较好的治疗疗效。然而镇肝熄风汤对帕金森病的治疗作用机制未明，本研究通过手术方法成功建立帕金森病大鼠模型,经镇肝熄风汤灌胃后，观察帕金森病大鼠的行为表现及大鼠脑纹状体内谷氨酸、谷胱甘肽变化，探讨镇肝熄风汤对帕金森病的治疗作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料和试剂 动物头颅立体定位仪(上海第二军医大学)；微量进样针 (重庆玻璃仪器设备厂)；6 -羟基多巴胺 (6 -OHDA Sigma公司)；阿扑吗啡 (APO，Sigma公司)；氨基酸自动分析仪；722分光光度仪(南京建成生物工程有限公司)；镇肝熄风汤组方：怀牛膝30 g，代赭石30 g，生龙骨15 g，生牡蛎15 g，生龟板15 g，玄参15 g，天门冬15 g，生白芍15 g，川楝子6 g，生麦芽6 g，茵陈6 g，甘草4.5 g。由山西省中西医结合医院药剂科提供标准免煎颗粒。

1.1.2 实验动物 健康清洁雌性Wistar大鼠，体质量(250±20)g，购于上海斯莱克实验动物有限公司[许可证号：SCXK(沪)2011 -0005]。

1.2 帕金森病大鼠模型的建立 将60只大鼠随机分为两组，模型组50只，正常组10只。模型组大鼠再次随机分为两组，40只为造模组，10只为假手术组。所有大鼠在相同环境饲养2 周，经旋转行为学测试无旋转行为的大鼠经手术造模，参照郭云霞等[2]的造模方法如下：术前12 h禁食，称重，6%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔内注射，麻醉后，俯卧位固定于脑立体定位仪上，头部消毒，沿正中矢状线暴露颅骨，调整门齿杆，使前后囟位于同一水平面上，于前囟后4.3 mm，矢状线右旁开1.5 mm，进针深度7.6 mm，牙科钻钻透颅骨，微量注射泵吸取6 -hydroxydopamine( 6 -OHDA) 8 μL，注射速度为1 μL /min，每次注射后留针5 min，缓慢出针，缝合头皮。假手术组以等量生理盐水进行上述操作，正常组不做任何处理。术后2 周进行旋转行为测试，给大鼠穿上束缚套后置于旋转检测仪中适应5 min，大鼠安静后皮下注射阿扑吗啡(0.5 mg/kg)，5 min后由旋转检测仪统一记录旋转次数，设定记录时间为30min，如大鼠恒定转向左侧，如30min旋转数>210 r，则为成功的帕金森病大鼠模型。

1.3 实验分组及干预措施 造模成功的30只帕金森病大鼠按随机原则分为2组，15只为治疗组，15只为对照组，同时设定10只为正常组，治疗组给予镇肝熄风汤灌胃，连续8 周；对照组、正常组同样方法给予等量生理盐水灌胃。

1.4 手术处理及取材 旋转行为测试：灌胃结束后进行测试，方法同造模中旋转行为测试法。将模型组及正常大鼠迅速断头取脑，分离纹状体，制成匀浆。

1.5 检测指标 经氨基酸自动分析仪测定谷氨酸。取组织匀浆上清液，通过722分光光度仪用化学比色法测定各组大鼠纹状体谷胱甘肽含量。

2 结 果

2.1 大鼠旋转行为比较(见表1)

表1 各组大鼠旋转行为比较(±s) r/min

2.2 大鼠纹状体内谷胱甘肽、谷氨酸含量比较(见表2)

组别n谷胱甘肽含量(mg)谷氨酸含量(μg)正常组10 16.60±1.62 62.50±5.02治疗组1514.50±1.201)2) 70.80±5.082)对照组15 12.52±0.731)80.60±7.491) 与正常组比较,1)P<0.05;与对照组比较,2)P<0.05。

3 讨 论

帕金森病是一种中老年人常见的运动障碍疾病，临床表现为肢体震颤、运动迟缓、肌僵直和姿势步态异常等。其病理特征是由于黑质 -纹状体多巴胺能神经元变性缺失。据统计资料表明：65岁以上的中老年人帕金森病患病率达2%以上，目前我国帕金森病病人已超过200万人。本病的研究历史将近200年，由于其病因和发病机制十分复杂，至今仍未彻底清楚，可能与年龄、环境因素、遗传等密切相关。导致黑质 -纹状体多巴胺能神经元变性坏死的确切机制尚不完全清楚，目前国内外大量研究均提示，氧化应激学说成为其发病的焦点，因此，氧化应激学说亦成为科学工作者的研究热点。正常组织细胞在自身生长、代谢过程中都可产生氧化应激产物，如活性氧(ROS)等，在正常情况下，机体存在氧自由基清除系统，脑组织内主要有谷胱甘肽等，从而保护机体免遭氧自由基的损伤。而随着机体的年龄增长，此消彼长，抗氧化系统清除氧自由基的作用逐渐衰退，致氧化应激产物不断增多，这些氧化应激产物堆积产生连锁反应，引起细胞组织相继损伤、凋亡、破坏，尤其活性氧对黑质 -纹状体多巴胺能神经元的破坏更为明显，导致细胞包括神经元变性坏死[3]。不仅如此，氧化应激还能产生一些因子促进、加速细胞的变性、坏死的连锁反应，如兴奋性氨基酸分泌过多，谷氨酸即为兴奋性氨基酸的一种[4]，可使钙超载从而使细胞线粒体功能受损，导致黑质 -纹状体中多巴胺神经元变性坏死[5]。因此，本研究的目的是通过镇肝熄风汤调节使抗氧化应激产物增多，如谷胱甘肽等，而使氧化应激产物减少，如兴奋性氨基酸——谷氨酸等，从而保护黑质 -纹状体多巴胺神经元。帕金森病因其发病率呈逐年升高趋势，及其致残率高，控制效果差，逐渐成为医学专家的研究重点。我国中医药博大精深，目前其尴尬及其困境在于作用机制不明。本课题研究主要探索中医药对帕金森病治疗的机制研究。

在中医学中帕金森病属于“颤证”范畴。中医学总结颤证一般分为以下5种证型：肝肾不足、阴阳两虚、血瘀生风、痰热动风、气血两虚，临床上以肝肾阴虚最常见。明代医学家孙一奎就从中医理论角度阐释了其发病机制：“此病壮年鲜有，中年以后乃有之，老年尤多，夫年老阴血不足，少水不能制肾火，极为难治”。病人多肝肾阴虚，肝风内动，故筋脉失养而致病。遵循中医辨证施治原则，临床上多采用镇肝熄风汤治疗帕金森病，且经临床证实，取得良好效果[6]。镇肝熄风汤为临床常用方剂，专为肝肾阴亏、肝阳上亢之证而设，有镇肝熄风、滋阴潜阳、止颤等功效。于振章等[7]将68例帕金森病病人随机分为对照组和治疗组，对照组给予美多巴片，并根据临床疗效调整剂量；治疗组在对照组治疗的基础上起始剂量时加用镇肝熄风汤加减，观察治疗前后临床疗效，统一用帕金森病评定量表评分，结果显示治疗组有效率明显高于对照组。张可可等[8]将56例帕金森病病人，且中医辨证均为肝肾阴虚型，随机分为两组，对照组给予美多巴等常规治疗，治疗组在对照组基础上加用镇肝熄风汤加减，结果显示：治疗组总有效率显著优于对照组，且治疗组美多巴用量较治疗前明显减少，病人依从性提高。本实验小组近3年来在临床工作中也在潜心研究镇肝熄风汤加减治疗帕金森病的临床疗效，通过研究表明，镇肝熄风汤能有效控制帕金森病症状，且能减少多巴丝肼药物的使用剂量，减少其不良反应及耐药性的出现。

而本次课题研究的重点在于从机制上研究镇肝熄风汤对帕金森病的影响，尤其研究其中的氧化应激机制。研究结果表明，镇肝熄风汤可通过增加帕金森病大鼠脑内抗氧化应激神经递质——谷胱甘肽，减少致氧化应激作用增强的兴奋性氨基酸——谷氨酸来发挥作用。