当归补血汤对糖尿病大鼠蛋白酪氨酸磷酸酶1B表达的影响

周 珍，王秀萍，张莹雯

(武汉大学中南医院，湖北 武汉 430071)

糖尿病是一种常见的内分泌疾病，因其并发症多、危害大、发病率高一直备受关注[1]。糖尿病病理机制复杂，与代谢异常、高糖-蛋白激酶C途径、氧化应激等有关[2]。而胰岛素抵抗是糖尿病典型的病理生理基础[3]，是指由于各种原因导致的靶器官对胰岛素的生理作用和敏感性降低，致使血液中的胰岛素发挥不了正常的降糖功能，人体肝脏、肌肉、脂肪等组织对胰岛素介导的葡萄糖的利用降低，从而导致血糖升高。蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)是蛋白酪氨酸磷酸酶中的一种，位于细胞质内质网表面，是目前研究胰岛素抵抗的新靶点，在胰岛素抵抗等多种信号通路中起着重要作用[4-5]。有研究表明，PTP1B在胰岛素抵抗信号转导途径中起着负性调节作用，抑制PTP1B活性可以促发胰岛素受体自磷酸化和胰岛素受体底物1(IRS-1)酪氨酸磷酸化，从而增加胰岛素敏感性来缓解胰岛素抵抗[6-7]。当归补血汤是祖国医学中补气养血的传统代表方，主治劳倦内伤、虚阳外浮、气弱血虚等病症。现代实验及临床研究表明其具有免疫调节性、抗氧化、心血管保护、降糖、降脂等多种作用，能通过抑制多个靶器官相关蛋白因子的表达,改善糖尿病及其并发症的病损变化[8-10]。本研究从抑制胰岛素抵抗、增加胰岛素的敏感性、抑制PTP1B蛋白表达等角度出发，探讨了当归补血汤治疗糖尿病的机制，旨在为其临床应用进一步提供理论基础。

1 实验资料

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级纯系正常SD雄性大鼠50只，体质量200～220 g，10周龄，购自武汉大学动物实验中心/ABSL-Ⅲ实验室(许可证号：ScxK2008-0004)，饲养于武汉大学动物实验中心。

1.1.2药材 当归补血汤(黄芪∶当归=2∶1，武汉大学中南医院中药房提供)，将黄芪、当归用自来水浸泡30 min后，分煎2次混匀，在水浴中浓缩，冷却后装瓶放于4 ℃冰箱备用；吡格列酮片(卡司平，购于武汉大学中南医院西药房)。

1.1.3主要试剂与仪器 链脲菌素(STZ)，购于美国Sigma公司，溶于1%柠檬酸钠缓冲液，pH 4.3；大鼠胰岛素(INS)酶联免疫吸附测定试剂盒，产品货号E-EL-R0023c，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；血糖试纸，美国强生；稳豪倍优型强生血糖仪，美国强生公司；倒置荧光显微镜，日本尼康Nikon Eclipse Ti-SR；瑞典BROMMA公司出产的LKB-V型超薄切片机；免疫组化试剂盒，武汉拜意尔生物科技有限公司。

1.1.4饲料 普通饲料(12%脂肪，60%碳水化合物，28%蛋白质)由武汉大学动物实验中心/ABSL-Ⅲ实验室提供，高脂高糖饲料(41%脂肪，41%碳水化合物，18%蛋白质)由北京华阜康生物科技有限公司提供。

1.2饲养条件 实验前所有大鼠均在室温(22±2)℃、相对湿度(55±5)%、光照周期12/12 h的环境中适应饲养1周。实验期间保证所有大鼠饮水、标准饮食充足，不予胰岛素治疗。

1.3糖尿病造模、分组及干预 大鼠适应性饲养1周，从中随机选取10只作为空白组、10只作为当归补血汤组，余30只进行高脂高糖饲料饲养4周后，注射小剂量STZ(30 mg/kg)，72 h后尾静脉取血测血糖，血糖≥16.7 mmol/L即为造模成功[11]。将30只造模成功大鼠随机分为糖尿病组、糖尿病+当归补血汤组、糖尿病+吡格列酮组，每组10只，均继续给予高脂高糖饲料饲养。当归补血汤组和糖尿病+当归补血汤组给予当归补血汤3.57 g/(kg·d)灌胃，糖尿病+吡格列酮组给予吡格列酮(片剂研磨成粉末，溶解于蒸馏水中)10 mg/(kg·d)灌胃，空白组和糖尿病组给予生理盐水5 mL/kg灌胃，均1次/d，连续5周。

1.4观察项目

1.4.1大鼠一般情况 观察各组大鼠饮水量、进食量、尿量、精神、毛色、有无感染等，测量实验开始前、灌胃前及灌胃5周后各组大鼠体质量。

1.4.2血糖、血清胰岛素水平 各组大鼠分别于灌胃前及灌胃5周后眼内眦静脉取血，采用美国强生血糖仪及配套试纸测定空腹血糖(FPG)，ELISA法测定空腹胰岛素(FINS)水平。

1.4.3肝脏和骨骼肌中PTP1B蛋白表达情况 灌胃5周后，无菌条件下取各组大鼠肝脏和骨骼肌，切成0.2 cm厚条形，用4%多聚甲醛固定，依次将切片放入二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸馏水洗，浸蜡后包埋，切片，脱蜡，修复抗原，加抗体，DAB显色，苏木素染色，脱水透明，树胶封片。用光学显微镜观察免疫组化切片(棕黄色深染区为阳性表达区)，应用图像分析系统分析切片的积分光密度(IOD值)：每组内每张切片分别随机挑选3个200倍视野进行拍照，对每张照片应用Image-Pro Plus 6.0软件进行分析得出每张照片阳性的IOD值。IOD值越大，表示阳性表达越强。以每组照片的平均IOD值代表该组的IOD值。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况与体质量变化 糖尿病组大鼠较空白组和当归补血汤组活动减少，毛发粗糙，色泽暗淡,这一情况在糖尿病+当归补血汤组和糖尿病+吡格列酮组得到明显改善，且实验期间糖尿病组相比其他各组进水量、摄食量、尿量增加。实验开始时各组大鼠体质量比较差异无统计学意义(P均>0.05)；灌胃前，各组大鼠体质量均明显高于实验开始时(P均<0.05)，且各造模组大鼠体质量均明显高于空白组和当归补血汤组(P均<0.05)，但各造模组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。灌胃5周后，空白组和当归补血汤组大鼠体质量持续增加，且明显高于实验开始时及灌胃前(P均<0.05)，但2组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)；各造模组大鼠体质量均较灌胃前明显下降(P均<0.05)，且均明显低于空白组和当归补血汤组(P均<0.05)，但糖尿病+当归补血汤组和糖尿病+吡格列酮组大鼠体质量均明显高于糖尿病组(P均<0.05)，而糖尿病+当归补血汤组和糖尿病+吡格列酮组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量变化情况

注：①与空白组和当归补血汤组比较，P<0.05；②与实验开始时比较，P<0.05；③与灌胃前比较，P<0.05；④与糖尿病组比较，P<0.05。

2.2各组大鼠灌胃前后FPG和FINS水平比较空白组和当归补血汤组大鼠灌胃前后FPG和FINS水平无明显变化(P均>0.05)。灌胃前，各造模组大鼠FPG和FINS水平均明显高于空白组和当归补血汤组(P均<0.05)，各造模组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。灌胃5周后，糖尿病组大鼠FPG和FINS水平无明显变化(P均>0.05)，糖尿病+当归补血汤组和糖尿病+吡格列酮组FPG和FINS水平均明显低于灌胃前及糖尿病组(P均<0.05)，而糖尿病+当归补血汤组和糖尿病+吡格列酮组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠灌胃前后FPG和FINS水平比较

注：①与空白组和当归补血汤组比较，P<0.05；②与灌胃前比较，P<0.05；③与糖尿病组比较，P<0.05。

2.3各组大鼠肝脏、骨骼肌中PTP1B蛋白表达情况

2.3.1免疫组化镜下表现 肝脏组织中，空白组和当归补血汤组阳性区域无明显差异，各造模组染色强度显著增强，阳性区域面积增大，且糖尿病组染色区颜色增强更为明显，见图1～5；骨骼肌组织中，各造模组细胞浆内部可见明显的深染颗粒呈棕黄色，糖尿病组更为明显，而空白组仅见少量阳性染色区，见图6～10。

图1 空白组肝脏组织中PTP1B表达情况(×200)

图2 当归补血汤组肝脏组织中PTP1B表达情况(×200)

图3 糖尿病组肝脏组织中PTP1B表达情况(×200)

图4 糖尿病+当归补血汤组肝脏组织中PTP1B表达情况(×200)

图5 糖尿病+吡格列酮组肝脏组织中PTP1B表达情况(×200)

图6 空白组骨骼肌组织中PTP1B表达情况(×200)

图7 当归补血汤组骨骼肌组织中PTP1B表达情况(×200)

图8 糖尿病组骨骼肌组织中PTP1B表达情况(×200)

图9 糖尿病+当归补血汤组骨骼肌组织中PTP1B表达情况(×200)

图10 糖尿病+吡格列酮组骨骼肌组织中PTP1B表达情况(×200)

2.3.2图像分析PTP1B表达量 各造模组肝脏和骨骼肌中的PTP1B表达量均明显高于空白组和当归补血汤组(P均<0.05)，糖尿病+当归补血汤组和糖尿病+吡格列酮组明显低于糖尿病组(P均<0.05)，而糖尿病+当归补血汤组和糖尿病+吡格列酮组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠肝脏、骨骼肌中PTP1B蛋白表达情况

注：①与空白组和当归补血汤组比较，P<0.05；②与糖尿病组比较，P<0.05。

3 讨 论

在机体的糖代谢过程中，胰岛素通过直接作用于肝脏、肌肉来维持着血糖的稳态[12-13]。在胰岛素信号传导过程中，分泌到体液中的胰岛素与胰岛素受体(IR)结合，IRb亚基通过自磷酸化使酪氨酸被磷酸化，从而激活IRb亚基上蛋白酪氨酸激酶(PTK)，使胰岛素受体底物(IRS)与IR结合，经过进一步激活糖代谢通路中的蛋白激酶B(PKB)和葡萄糖转运体4(GLUT4)，使体内的糖脂代谢被启动。在整个信号传导过程中，酪氨酸的磷酸化是可逆的动态过程，其中PTK负责磷酸化过程，蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP)负责去磷酸化过程。PTP1B是PTPs家族的一员，PTP1B通过作用于胰岛素受体、胰岛素受体底物等，使其去磷酸化而失活，最终胰岛素信号传导被终止，从而糖脂代谢被终止[14]。由此可见，在整个信号传导过程中PTP1B起着重要的负调控作用，若PTP1B在脂肪细胞、骨骼肌和肝脏细胞中表达过度或活性增强，能使胰岛素受体底物去磷酸化来终止胰岛素信号的传导，阻断胰岛素信号通路产生胰岛素抵抗[15-16]。因此若能找到一种抑制PTP1B表达的药物，就能提高胰岛素受体及其底物的磷酸化水平，减弱PTP1B对胰岛素受体底物的去磷酸化作用，就能起到类胰岛素或胰岛素增敏的效果。

糖尿病属于祖国医学中“消渴”范畴，针对其病机的当归补血汤由具有益气活血作用的黄芪、当归组成。现代药理研究表明当归补血汤有调节免疫、保护心血管系统、抗纤改善凝血机制、纠正糖及脂蛋白代谢异常、抗氧化和清除自由基等作用[17]。《内外伤辨惑论》中当归补血汤的黄芪与当归用量为5∶1，本方中沿用前期研究[9-10]的黄芪当归用量2∶1。其中黄芪能改善糖尿病患者的胰岛素抵抗[18],其主要活性成分黄芪多糖具有抗氧化、清除氧自由基作用，可通过缓解氧化应激反应[19]、减少炎性因子白细胞介素-6的分泌[20]或通过抑制PTP1B的表达改善胰岛素抵抗[21]。当归补血活血，可运载阳气到达全身使阳生阴长，血运正常，当归中有效成分当归多糖亦有改善胰岛素抵抗作用[22]。

本研究运用高脂饮食加STZ干预成功诱导出大鼠糖尿病动物模型，FPG、FINS升高，经当归补血汤干预后，FPG、FINS明显下降，大鼠的一般情况也得到改善，且其与吡格列酮降糖效果相当。然对正常大鼠进行当归补血汤灌胃后，其血糖并未下降。说明当归补血汤有明显的降糖作用，主要是降低高血糖，对正常血糖并无影响。且通过免疫组化检测到糖尿病组大鼠肝脏和骨骼肌中PTP1B蛋白表达明显增加，进一步证实了糖尿病的发病机制与胰岛素抵抗有一定的关系。而经当归补血汤干预后，PTP1B蛋白表达明显降低，且与吡格列酮组下降程度无明显差异。说明当归补血汤降糖作用可能是通过降低肝脏和骨骼肌组织中PTP1B的蛋白表达，从而增强胰岛素信号传导，参与调节糖代谢。然而当归补血汤降血糖作用是否仅仅从这一条途径发挥作用及其增加胰岛素敏感性的确切机制都有待进一步研究证实。