甘蓝型油菜BnTCP7基因的克隆和表达分析

刘双双，蒋学飞，岳 出，王茂林

(四川大学 生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都 610064)

TCP转录因子家族是根据玉米(Zeamays)中的TEOSINTEBRANCHE1 (TB1)、金鱼草(Antirrhinummajus)中的CYCLOIDEA(CYC)以及水稻(Oryzasativa)中的PROLIFERRATINGCELLFACTORS1和2(PCF1和PCF2)的3个基因的首字母来命名的[1]。TCP家族是植物特有的一类转录因子[2]，含有一个bHLH motif，能够与DNA结合或者产生蛋白质与蛋白质的互作[3]。基于TCP结构域序列上的差别，TCP转录因子家族被分为2个亚家族：classⅠ(PCF或TCP-P)和Ⅱ(TCP-C)，主要是因为classⅠ和Ⅱ相比，在TCP基本结构域上缺失了1个包含4个氨基酸残基的结构，此外classⅠ和Ⅱ的蛋白识别位点也有所差异，分别为GGNCCCAC和G(T/C)GGNCCC[4]。TCP家族参与了调控植物细胞增殖和分化，其中classⅠ类在植物生长以及胁迫应答中起正调控作用，而classⅡ则与Ⅰ类功能有所拮抗[5]。

据报道，通过酵母单杂交筛选分离方法，得到的TCP家族AtTCP7基因可能是拟南芥miR168a调节因子，但在体内实验中，通过过量表达该基因和GUS染色发现，AtTCP7可能不直接与miR168a的启动子作用。在转基因品系的表型分析中发现多种生长缺陷和发育延迟，包括根较短、开花延迟和育性降低等特征。不同发育阶段分析表明，过表达AtTCP7通过改变细胞周期基因表达限制细胞从G1到S期的转变，在不同器官中差异性地影响细胞大小和DNA含量。同时，TCP家族成员之间存在复杂的相互作用遗传网络，特别是TCP7和TCP23之间通过相互作用发挥功能[6]。在拟南芥TCP蛋白相互作用中发现：TCP7/8/22/23在幼叶生长中具有相似表达模式，TCP4/7/9/14/15/17/21/22/23在花的发育中的功能可能具有相似性[7]。最近也有文献报道，拟南芥中classⅠ类的6个TCPs基因可能是3对重复基因，分别为tcp6-tcp20、tcp7-tcp21和tcp9-tcp19[8]。最近，芜菁(Brassicarapa)基因组TCP家族分析发现TCP7基因存在BrrTCP7、BrrTCP7a和BrrTCP7b等3种，且BrrTCP7在根、茎、叶中均呈现高表达，BrrTCP7a在所有器官中的表达水平较低，而BrrTCP7b在叶片和花中表达量较高。通过酵母双杂交技术研究芜菁TCP蛋白之间的相互作用，发现TCP7几乎与所有BrrTCP蛋白均能产生同源或异源二聚体[9]。

目前针对甘蓝型油菜TCP7基因在植物生物胁迫和非生物胁迫方面的研究还比较少。油菜属于十字花科、芸薹属植物，是世界重要的油料作物之一，也是主要经济作物[10]，本研究通过克隆后比对分析，获得了甘蓝型油菜预测转录因子TCP7-like同源编码基因，命名为BnTCP7，分析了该基因的氨基酸序列和表达模式，为深入研究油菜BnTCP7在植物抗逆响应中的功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

甘蓝型油菜(Brassicanapus)‘3529’由本课题组提供，种植于四川大学试验地。

1.2 方 法

1.2.1BnTCP7编码区全长的克隆按照植物总RNA提取试剂盒(OMEGA公司)说明书，以油菜叶片为实验材料提取总RNA，cDNA第一链合成按照反转录试剂盒TransScript One-Step gDNA Remvoal and cDNA Synthesis Super Mix(全式金生物公司)的操作步骤进行。反转录后用内参基因-Actin检测cDNA质量，合成的cDNA可直接作为PCR反应模板使用，或者-20 ℃保存。参考转录组BnTCP7基因的ORF序列，利用Primer3 Plus在线设计引物(表1)。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA纯化回收试剂盒(天根生物公司)按照从PCR反应液直接回收方法进行回收，

表1 引物序列

回收产物连接Peasy-T1载体(全式金生物公司)，转化Trans-T1感受态细胞。蓝白斑筛选阳性克隆后，经菌液PCR检测，选取阳性菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中进行扩大培养并提取质粒。按照质粒小提试剂盒(天根生物公司)说明书的方法进行提取，后送生物公司(深圳华大基因有限公司)测序。

1.2.2BnTCP7基因编码区序列的生物信息分析目的基因测序结果用DNAMAN软件分析。将BnTCP7基因序列在GenBank中进行Blast比对，利用BnTCP7基因的预测氨基酸序列进行氨基酸序列比对分析。BnTCP7蛋白理化性质通过Protparam[11]在线软件分析，BnTCP7蛋白亲水/疏水性使用ProtScale在线分析软件Kyteand Doolittle算法进行预测。使用SOPMA[12]对BnTCP7蛋白二级结构进行预测，而BnTCP7蛋白三级结构同源建模应用SwissModel在线工具分析。用MEGA 7. 0软件构建系统发育进化树。

1.2.3不同时期不同器官BnTCP7基因的表达模式分析根据本课题组已有转录组数据，分析甘蓝型油菜‘3529’各个时期各个器官中BnTCP7基因的表达模式，为深入研究BnTCP7基因功能提供依据。

1.2.4BnTCP7基因在逆境胁迫和外源激素处理下的表达模式分析甘蓝型油菜品系‘3529’露天盆栽，培养至幼苗3～4片真叶时，开始进行胁迫及激素处理。激素处理为100 μmol/L ABA和100 μmol/L GA3，分别添加 0.05%(V/V)乙醇和0.01% Tween-20表面活性剂，喷施叶面和浇灌根部；损伤处理为用打孔器在叶片上打孔(30%体积)；高温、低温处理为将甘蓝型油菜幼苗分别放置40 ℃光照培养箱和4 ℃冷室内，正常光照进行处理；未经过任何处理的作为空白对照。所有材料在处理后 0、0.5、1、2、4、8和16 h 取生长状况一致的幼苗地上部分，液氮冷冻后于-80 ℃保存。以油菜管家基因 -Actin(GenBank登录号AF111812)作为内参基因，设计特异性引物(表1)，qRT-PCR检测BnTCP7基因在不同胁迫、不同时间点下的表达情况。荧光定量PCR仪为美国Bio-Rad CFX96。荧光定量试剂盒采用TransStart Tip Green qPCR Super Mix(全式金生物公司)。qRT-PCR反应20 μL体系如下：10 μL 2×Master Mix，1 μL模板cDNA，10 μmol/L正反向引物各1 μL，7 μL ddH2O。qRT-PCR采用三步法，反应程序为：94 ℃预变性30 s，42个循环(94 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s 及72 ℃ 10 s)，同时绘制熔解曲线(65 ℃上升至95 ℃，每个循环上升0.5 ℃)。反应结束后，目标基因表达水平运用相对定量的2-ΔΔCt法[13]，得到BnTCP7基因的相对表达量，每个样品都进行3次重复实验。数据采用SPSS进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 BnTCP7基因全长的克隆与编码蛋白质分析

由甘蓝型油菜苗期叶片为材料获得的cDNA为模板通过PCR扩增(图1)，得到648 bp编码区全长。PCR产物经纯化后连接T载体并转化涂在具有卡那抗性的平板上，过夜培养，挑取单菌落进行重组子鉴定后扩大培养，菌液送深圳华大基因有限公司测序，测序后利用NCBI数据库Blastn比对，成功获得TCP7基因，命名为BnTCP7。将克隆得到的序列与甘蓝型油菜基因组序列进行Blast比对，发现与甘蓝型油菜预测转录因子TCP7-like(NC_027757)为同源基因，核苷酸序列相似性最高，为95.68%。同时，其氨基酸序列与十字花科(Brassicaceae)中19条TCP7或者TCP7-like基因的氨基酸序列比对，结果(图2)表明，拟南芥属、亚麻荠属、芸薹属和萝卜属等TCP7间同源蛋白具有很高的相似性和保守性，尤其表现在靠近N端的TCP保守结构域。

2.2 BnTCP7蛋白性质与结构预测分析

2.2.1氨基酸序列理化性质分析BnTCP7蛋白理化性质利用在线软件Protparam分析。BnTCP7蛋白相对分子质量为23 018.77；不稳定系数是47.77(不稳定系数大于40时，预测蛋白质不稳定，反之则稳定)，为不稳定类蛋白；等电点为9.38；总平均疏水性为-0.457。结果表明，该蛋白为不稳定、亲水性蛋白。

M. 250 bp DNA ladder; 1.‘3529’图1 BnTCP7 基因 PCR 扩增片段Fig.1 PCR amplified fragment of BnTCP7

2.2.2BnTCP7蛋白质二级结构及三级结构预测利用SOPMA对BnTCP7蛋白二级结构进行预测[12]，并与拟南芥AtTCP7(NC_003076)蛋白预测结构进行比对，图3，A1和3，A2分别为BnTCP7和AtTCP7蛋白二级结构预测结果，主要显示蛋白结构中的α-螺旋、β-片层等结构。应用SwissModel在线工具对BnTCP7及AtTCP7氨基酸序列进行三级结构同源建模。BnTCP7氨基酸序列预测得到三级结构构象有2个，构象1和构象2分别见图3，B1、B2，2个构象共存时构象见图3，B3；AtTCP7氨基酸序列预测得到的三级结构关键构象也具有2个独立构象(图3，C)；图3，B3和图3，C中构象均存在螺旋-环-螺旋结构，进一步证明属于TCP家族，且BnTCP7和AtTCP7部分构象一致。

NC_027757、NC_027774、NC_027762、NC_027768、NC_027758. 甘蓝型油菜; NC_024795v、NC_024800、NC_024796. 白菜; NC_027756、NC_027754、NC_027749. 甘蓝; NW_017353147、NW_017353142. 萝卜; NC_025697、NC_025692、NC_025704. 亚麻芥属; NW_003302550.琴叶拟南芥; NC_003076. 拟南芥图2 BnTCP7与十字花科中其他19个TCP7或TCP7-like氨基酸序列比对NC_027757, NC_027774, NC_027762, NC_027768, NC_027758. Brassica napus (rape); NC_024795v, NC_024800, NC_024796. Brassica rapa (field mustard); NC_027756, NC_027754, NC_027749. Brassica oleracea (wild cabbage); NW_017353147, NW_017353142, NW_017353144. Raphanus sativus (radish); NC_025697, NC_025692, NC_025704. Camelina sativa (false flax); NW_003302550. Arabidopsis lyrata; NC_003076. Arabidopsis thalianaFig.2 Comparison of BnTCP7 with other 19 TCP7 or TCP7-like amino acids in Brassicaceae

A1. BnTCP7蛋白二级预测结构; A2. AtTCP7蛋白二级预测结构; B1. BnTCP7蛋白三级结构预测构象1; B2. BnTCP7蛋白三级机构预测构象2; B3.构象1和构象2共存时构象; C. AtTCP7蛋白三级结构预测构象; A1、A2中绿色为β-转角，红色为片层，紫色为无规卷曲，蓝色为α-螺旋图3 BnTCP7 蛋白二级和三级结构预测A1. Prediction of protein secondary structure of BnTCP7; A2. Prediction of protein secondary structure of AtTCP7; B1. Prediction of protein tertiary structure of model1 in BnTCP7; B2. Prediction of protein tertiary structure of model 2 in BnTCP7; B3. Conformation of the coexistence of model1 and model 2; C. Prediction of protein secondary structure of AtTCP7; A1, A2. Green: β-turn; Red: extended; Purple: random, coil, strand; Blue: α-helix.Fig.3 Prediction of secondary and tertiary structures of BnTCP7 protein

2.3 BnTCP7蛋白系统进化树的构建

为研究十字花科植物TCP7基因的蛋白质系统进化情况，对NCBI数据库十字花科中19个TCP7及TCP7-like基因预测的氨基酸序列构建进化树，其中涉及4个属分别为拟南芥属、亚麻荠属、芸薹属和萝卜属，并结合BnTCP7基因预测的氨基酸序列构建进化树。利用MEGA7.0软件[14]中Neighbor Joining算法[15]构建系统进化树[16](图4)，使用泊松校正方法计算进化距离[17]。结果表明，20条蛋白序列具有很高的同源性，BnTCP7与Brassicanapus(rape)NC_027757聚在同小一分支，亲缘关系最近；与Raphanussativus(radish)NW_017353147等聚在同一大分支，与陆奇丰等结果相同[18]。进化距离表明，20个基因的蛋白质遗传进化距离很近，进一步说明该TCP家族蛋白质遗传进化比较保守。

2.4 不同时期不同器官BnTCP7基因的表达模式分析

利用转录组数据对不同时期不同器官BnTCP7基因在‘3529’中的表达模式分析，结果如图5所示。各个时期各个器官中BnTCP7基因的表达呈现一定差异性，BnTCP7基因在花期茎中表达量相对最高，而在花期叶、角果期角果中表达量相对较少，其中角果中表达量最低；BnTCP7基因在苗期和抽薹期各部位中表达量差异不显著，而在花期叶片中表达量较其他组织部位低。

图4 BnTCP7与十字花科中其他19个TCP7或TCP7-like蛋白序列的系统进化树Fig.4 Phylogenetic analysis of BnTCP7 with other 19 TCP7 or TCP7-like protein in Brassicaceae

2.5 非生物胁迫和外源激素处理下BnTCP7的表达模式分析

通过分析甘蓝型油菜‘3529’不同时期的转录组数据，发现BnTCP7基因在苗期表达量较稳定；并且，苗期更适宜于研究BnTCP7基因对非生物胁迫和外源激素处理的响应，因此本实验选用苗期材料。非生物胁迫和外源激素处理后苗期中BnTCP7表达量变化如图6所示，其中不同胁迫处理实验均以β-Actin为内参基因，以0 hBnTCP7在‘3529’中的表达量为1得到不同时间段‘3529’中BnTCP7基因的相对表达量。

分析发现，‘3529’在冷胁迫下，BnTCP7表达量随着时间延长逐步降低，在8 h表达量达到最低。而在热胁迫下，BnTCP7表达量随着时间的变化呈先下降后上升趋势，在2 h表达量达到最低点。损伤胁迫下，BnTCP7表达量在0.5 ～ 4 h时间段内稳定低表达，但在8 h大幅升高至0 h表达水平，差异不显著，后继续下降。在ABA和GA3处理后，BnTCP7表达量在早期都呈大幅度下降趋势，但是它们下降到最低值的时间点和恢复到最高值的时间点均不一样，其中GA3处理下，BnTCP7在0.5 h下降至最低点后逐渐上升并在2 h表达量上升到初始状态，2 h后下降并呈稳定低表达；施加外源ABA后，BnTCP7表达量在1 h下降到最低点后逐步上升，且8 h表达量高于处理前状态后下降。

ss.苗期; bs.抽薹期; fs.花期; ps.角果期图5 ‘3529’不同时期不同器官BnTCP7基因的相对表达量WT represent ‘3529’ of Brassica napus; ss represent the seedling stage; bs represent the bolting stage; fs represent the flowering period; ps represent siliquing stageFig.5 Analysis of BnTCP7 gene’s relative expression in different stages and organs of ‘3529’

*代表该处理下BnTCP7基因表达量与0 h(未处理)的表达量存在显著差异(P<0.05)图6 非生物胁迫和外源激素处理下BnTCP7基因的相对标准表达量*means that the expression of BnTCP7 gene there is a significant difference between the treatment time 0 h (untreated conditions) and other treatment time under the same condition at 0.05 levelFig.6 Relative normalized expression levels of BnTCP7 under abiotic stresses and hormone treatments

综上，表达量总体变化趋势分为两类：第一类，BnTCP7在损伤胁迫和外源激素ABA及GA3处理下基因表达量随着处理时间延长，均为先下降再上升后下降趋势；第二类，在冷、热胁迫处理条件下基因表达量随着胁迫时间延长，整体呈下降趋势。总之，非生物胁迫和外源激素处理下，‘3529’中BnTCP7的表达量与0 h相比均整体呈下降状态且差异显著(P<0.05)。说明BnTCP7参与到了冷、热、损伤胁迫中,并受ABA及GA3激素的影响。

3 讨 论

转录因子在植物抵御外界生物和非生物胁迫过程中发挥重要调控作用，且在不同物种中其功能高度保守[19]。其中，TCP转录因子参与多种激素信号通路的调节，且具增强植物抵御外界胁迫的能力[20]。据报道，白桦BpTCP7基因过表达提高了盐、旱耐受能力[6]，水曲柳FmTCP4基因能够被寒冷、盐、干旱等非生物胁迫诱导表达，并参与了ABA和GA3的激素信号转导过程[4]。目前，TCP家族在拟南芥[21]、水稻[22]和番茄[23]中研究比较多，但对芸薹属植物的研究比较少，特别是甘蓝型油菜抗逆响应方面。本研究通过基因克隆、序列比对分析获得了甘蓝型油菜转录因子TCP7-like同源基因，命名为BnTCP7，属于TCP家族classⅠ类，与TCP7-likeNC_027757基因核苷酸序列具有最高的相似性(95.68%)。生物信息学结果表明BnTCP7蛋白为亲水性蛋白，同时，结合NCBI数据库十字花科中19个TCP7及TCP7-like基因的蛋白序列构建进化树。氨基酸序列比对、BnTCP7蛋白三级结构同源建模及进化树分析等进一步验证BnTCP7蛋白具有bHLH(basic helix-1oop-helix)结构与陆奇丰等[18]及刘春浩等[4]结论一致，属于TCP家族，与TCP7-likeNC_027757基因具有最近的遗传进化关系。

基于转录组数据，本研究分析了BnTCP7基因在不同时期不同器官中的表达模式。BnTCP7基因在营养器官中的表达量高于生殖器官，且在营养生长阶段表达趋于稳定，结合TCP家族在植物生长发育中的作用，推测可能TCP家族基因更多地参与植物营养生长阶段。此外，甘蓝型油菜‘3529’苗期在不同胁迫处理后叶中BnTCP7基因表达的模式分析表明，在非生物胁迫和激素处理下，甘蓝型油菜‘3529’中BnTCP7表达量随时间的改变而变化显著。同时，值得注意的是在ABA和GA3处理后，BnTCP7表达量变化趋势一致，但是BnTCP7对2种激素的响应快慢不一，即ABA处理下响应速度快于GA3处理，推测可能和油菜内源激素水平有关，因为有研究发现苗期至盛花期GA3水平高于ABA[24]。

总之，BnTCP7基因不仅响应冷、热、损伤的非生物胁迫，并且参与ABA和GA3激素的信号转导，说明甘蓝型油菜BnTCP7基因可能在植物抵抗逆境胁迫响应中发挥作用，为进一步研究TCP转录因子在甘蓝型油菜抗逆机制中的作用提供参考。