棉花光敏雄性核不育突变体PSM4创制及其特性研究

张朝军

(中国农业科学院 棉花研究所， 河南安阳 455000)

棉花是一种杂种优势十分明显的经济作物，优势不仅表现在株高增高、叶面积增大、光合产物积累多、积累速度快、果枝数多、果枝增长迅速等个体营养生长优势，也表现在结铃多、铃重增加等产量优势；在耐高温、耐湿、耐旱、耐瘠、耐病等环境适应性方面也有显著优势[1]。棉花生产上推广应用的杂交种主要是通过人工去雄、人工辅助授粉配制的，如‘中棉所70’[2]。人工制种加大了棉花杂交种成本，严重限制了杂交棉的推广应用。培育雄性不育系是解决棉花杂种优势利用问题的关键。

棉花不育系可以分为胞质不育系(CGMS)和核不育系(GMS)两种。从20世纪60年代至今，报道的棉花细胞质不育系主要有哈克尼西棉胞质不育系(D2-2)[3-4]、亚洲棉(A2) 胞质不育系、异常棉(B1) 胞质不育系[5-9]、三裂棉胞质不育系(D8)[10]、陆地棉(AD1) 胞质不育系和海岛棉胞质不育系(AD2)。恢复系基因型主要有Rf1和Rf2。Rf1基因既能恢复CMS-D2的育性，也能恢复CMS-D8的育性，而Rf2只能恢复 CMS-D8 的育性[11]，Rf1、Rf2已找到连锁的分子标记位点[11-12]。

棉花的核不育系分为两种类型，一种为核基因控制的不育系，已报道的有17个不同类型，包括ms1、ms2、ms3、ms5ms6[13]、ms8ms9、ms13、ms14、ms15 和 ms16[14]等9个隐性核不育系，以及Ms4、Ms7、Ms10、Ms11、Ms12、Ms17、Ms18和Ms19[15]等8个显性核不育系。其中，12个是在陆地棉中发现的，5个发现于海岛棉中。 ms2和 Ms4等为完全不育，ms1和ms3等仅是部分不育，ms8ms9则表现为花药不开裂。其中的ms5、ms8 和 ms9 等已经找到相关的分子标记[16]。Yue等[17]对 ms5ms6 双隐性不育突变体进行了研究，鉴定到了58个差异蛋白。另一种核不育系是受环境因素调控的核不育系，目前报道的主要有温敏不育系和光敏不育系。其中，湖南农业大学培育的棉花温敏雄性不育系‘特棉S-1’，在日平均温度高于27 ℃生长条件下表现为不育[18]。湖北省荆州市农业科学院从‘洞A’的杂交后代中选育到了一个光敏不育材料NFBY0408[19]。中国农业科学院棉花研究所利用航天诱变育种技术培育出新型的棉花光敏雄性不育突变体——‘中 9106’，‘中 9106’ 在光照周期为 13～14.5 h的长日照条件下表现不育，在光照周期为11～12.5 h，日平均温度大于等于21.5 ℃的短日照条件下生长时表现可育(ZL201110294545.4)。本研究利用棉花大规模组织培养技术获得突变体材料，于2012年在组织培养再生植株后代中发现不育株。2012～2017年对不育材料进行了系统研究，确定为只受光周期诱导的新型光敏不育材料，为棉花种质创新提供了特异材料，为棉花杂交制种提供新的技术途径。该材料的应用将有效降低棉花杂交种制种成本，进一步推动中国棉花种业的发展。

1 材料和方法

1.1 试验材料与地点

采用陆地棉W10组织培养体系(ZL200610089439.1)，利用W10无菌苗的下胚轴组织培养，获得大量再生植株，从中选择突变体。 2012年获得9株不育材料，依据在海南的表型分为PSM1、PSM2、PSM3、PSM4(photoperiod sensitive male sterility mutant of cotton)突变体。对PSM4在海南三亚市吉阳镇的中国农业科学院棉花研究所南繁基地(以下简称为三亚)和河南安阳市中国农业科学院棉花研究所试验田(简称安阳)进行系统研究。

1.2 育性稳定性试验

在安阳大田进行PSM4育性稳定性试验，以W10为对照，每个处理1行，设置3个重复。分别在7月15～20日、8月15～20日、9月15～20日进行自交。每个时期每个处理自交300朵花，用不同颜色的毛线标记，同时每个时期随机选取50朵PSM4的花，用W10做父本进行杂交，10月10日调查自交、杂交铃数。

1.3 安阳光周期响应试验

采用黑绒窗帘布制作长方体遮光罩，遮光罩长100 cm、宽80 cm、高120 cm，为了强化遮光效果和减少光照对箱体内温度影响，在绒布外层加装1层锡箔纸，用于反光。每个遮光罩可以罩住3株棉花，3个重复共遮光处理9株棉花，对照为W10。2015年6月15日开始第1次遮光处理，开始遮光时间为16:30和17:40，7月5日结束处理； 8月5日开始第2次遮光处理，开始遮光时间为17:00和18:20，8月25日结束； 保证光照时长分别为≤11.5 h和≥12.5 h。持续处理20 d后观察育性变化情况。处理期间晚上8:00天黑后将遮阳罩移开，以免干扰棉花夜间生长发育。开花后观察散粉情况，并进行自交。

1.4 遗传规律试验

选取W10、‘中棉所12’、‘中棉所19’、‘中99668’、‘泗棉3号’、‘新陆早12’等材料与PSM4进行正反交，在三亚和安阳观察F1代育性，2016年在安阳调查F2代分离规律。

1.5 开花后花药石蜡切片观察

取安阳大田中W10和PSM4植株上取不同发育时期的花蕾，用FAA固定液固定，24 h以后转入70%乙醇中低温(4 ℃)保存。再用酒精梯度(70%、85%、95%、100%)脱水，二甲苯透明，然后经渗蜡、包埋，最后进行切片，厚度为8 μm，番红-固绿染色，中性树胶封片，制成永久切片。用Olympus BX51显微镜观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 PSM4的创制

利用W10无菌苗下胚轴进行组织培养， 2011年初获得的一批再生植株在三亚种植，组织培养再生植株标记为E0代，自交后收获E1代；E1代在三亚种植株行，2012年4月株行混收的E2种植在安阳进行性状观察，在同一再生植株的后代群体中发现9株雄性不育株。同年选取不育株上健壮的果枝顶端芽嫁接到W10砧木上，定植到三亚。在三亚发现嫁接的雄性不育株在12月至次年2月底表现为雄性可育，其他时间表现为雄性不育。将这9株不育株的后代在海南三亚大田种植时，叶色分离为4种，即真叶重度黄化型、轻度黄化型、绿偏黄型和正常绿色类型，分别命名为PSM1、PSM2、PSM3和PMS4，这4种材料有着相同的光敏不育特性(图1)。本研究仅对叶色正常的PSM4研究进展进行报道。

2.2 PSM4育性稳定性试验结果

从表1可以看出，PSM4连续3年自交，没有得到一个自交铃，可见PSM4在整个生育期均表现为自交不育，雄性不育性状可以稳定遗传给后代。利用PSM4做母本，W10做父本杂交，在整个生育期均能获得杂交铃，可见雌性育性不受影响。杂交铃成铃率比W10略高，主要是不育株上自交不结铃导致单株总铃数较少，从而提高了杂交结铃率。

2.3 PSM4在安阳的遮光试验

2015年6月15日和8月5日在安阳大田进行了2次遮光试验。试验结果(表2)表明，在第1次遮光处理期间，W10在遮光处理和正常生长条件下均表现为正常可育、自交结铃，田间观察不到花粉量和育性变化现象。当光周期控制在12.5 h时，遮光的PSM4与大田PSM4植株一样，观察不到散粉情况，自交不结铃。当光周期控制在11.5 h时，PSM4可以观察到与W10同样的散粉情况，自交结铃；7月15日后可以明显观察到PSM4花粉量减少，7月20日后，PSM4重新转变为花药不开裂，无散粉现象，自交不结铃。在第2次遮光处理期间，W10仍正常可育，田间观察不到育性和生长发育情况差异。在光周期12.5 h处理下，PSM4植株仍然保持花药不开裂、无花粉的雄性不育状态；光周期11.5 h处理条件下，PSM4植株在遮光处理到8月18日开始出现花粉，于8月21日花粉量达到W10水平，并全部转变为自交可育，8月25日停止遮光处理后， 9月2日后出现花粉量变少，自交仍可结铃；到9月7～10日重新转化为雄性不育，直至植株自然死亡，观察不到花粉，自交不结铃。因此，可以推断PSM4育性完全受光周期调控，对光周期反应十分敏感，育性转变对光周期的响应关键期可能在开花前12～15 d，这一现象在其他棉花光敏不育系中未见报道。

表2 PSM4短日照处理育性变化情况

2.4 PSM4育性变化对光周期响应的推测

棉花是多年生木本植物，在三亚种植一次可以观察多年。经过2014年5月播种到2016年5月连续2年观察PSM4育性转变时间，发现PSM4在11月15日前后开始出现花粉，并可以自交结铃，进入可育阶段；到第二年3月1日前后，开始出现花粉减少，直至花药不开裂、花药上无花粉粒、自交不结铃等现象，逐渐进入雄性不育阶段。因此PSM4在三亚自交可以结铃时期为11月下旬到次年的3月上旬。结合安阳遮光试验结果，即花药败育出现在开花前约13～15 d，将PSM4育性转变阶段前推15 d可能是决定花粉育性的关键时期，结合三亚日照时数(表3)可以看出PSM4育性转变的光周期为光照时间11.5 h/黑暗时间12.5 h左右，当日照时数大于12 h时表现为不育，当日照时数在11.5～12 h时是育性转变期，花粉较少，当日照时数小于11.5 h时完全可育。

2.5 PSM4在安阳的花及花药观察

图2显示，PSM4突变体在安阳种植，表现为花朵略小于W10。萼片、花冠、子房均明显变小，花药数量减少，花药不开裂。柱头和正常棉花植株一样，开花当天柱头隐藏在花药之中，这与已经报道的棉花不育系有明显区别。开花第2天，可见对照W10和突变体材料PSM4柱头略有伸长，均高于花药；体视显微镜观察结果显示，PSM4仍保持花药不开裂性状，花药上观察不到花粉粒。

表3 PSM4育性转变期海南省三亚市吉阳镇日照时数

注：2015年11月11日前为雄性不育时期，11月12日至11月22日为花粉逐渐增多变为雄性可育时期；2016年2月17至2月29日为雄性可育时期，3月1日～3月10日花粉量减少，转变为雄性不育。3月12日后进入不育阶段。数据来源https://richurimo.51240.com/

Note：The sterile stage before 11 Nov. 2015. The turning stage from sterility to fertility 12 Nov. 2015 to 22 Nov. 2015. The fertile stage 23 Nov. 2015 to 29 Feb. 2016. The turning stage from fertility to sterility 1 Mar. 2016 to 11 Mar. 2016. The sterile stage after 12 MAR. 2016. Data from https://richurimo.51240.com/

另外，取安阳种植的PSM4和W10开花后第2天花药进行石蜡切片观察(图3)，沿着花药丝方向切开定义为纵切图，与花药丝垂直方向切开定义为横切图。从图3中可以看出，W10的花药室完全打开，在花药固定液处理时，花粉粒已经完全被固定液洗脱，没有花粉粒残留，说明W10花药开裂正常，花粉粒能够完全散出。观察PSM4的花药发现，花粉室不开裂，内部残留的败育花粉粒清晰可见；残留的花粉粒细胞壁上没有正常花粉粒的刺状凸起，花粉外壁是绒粘层在单核靠边期合成并提供物质给花粉外层的，而棉花花粉发育从单核靠边期到开花约需15 d，这与前面的遮光处理结果基本吻合。可以基本认定PSM4败育的原因是在长日照条件下，绒粘层的花粉粒外壁物质合成受阻导致的。

a、c. W10花朵，b、d. PSM4花朵; e. 体视显微镜下W10开花第2天的雄蕊和柱头；f.体视显微镜下PSM4开花第2天的雄蕊和柱头图2 PSM4与W10的花形态比较a,c. The flower phenotype of W10; b,d. The flower phenotype of PSM4; e. The stamen and stigma phenotype of W10 at 2 DPA were observed under stereomicroscope; f. The stamen and stigma phenotype of PSM4 at 2 DPA were observed under stereomicroscopeFig.2 The flower phenotype of PSM4 and W10

2.6 阴雨天气下 PSM4育性稳定性

2017年7～8月连续20多天的阴雨天气(表4)，在没有阳光直射的条件下对20行PSM4进行60 d自交处理，共对3 562朵花进行自交，没有获得一个自交铃。田间观察没有发现花药散粉现象。可以推断PSM4的光敏核不育特性不受长期阴雨天气的影响。在安阳直到10月20日棉花收获完成，花药仍无开裂散粉现象，因此在安阳整个生育期PSM4均表现为雄性不育。

2.7 PSM4育性遗传规律

2014年利用PSM4做母本，利用W10、‘中棉所12’、‘中棉所19’、‘中99668’、‘泗棉3号’、‘新陆早12’做父本，在安阳配置杂交组合，各组合F1代在三亚、安阳均可育，育性与父本无差异。2014年冬季对所有组合做正反交，收获F1代，2015年在安阳、三亚分别种植F1代，F1代均可育，观察不到雄性不育株。因此，可以推断PSM4育性受核基因控制，是隐性核不育的一种。各杂交组合F2代在安阳种植，可以分离出不育株，F2代分离情况见表5。经x2测验检测发现，除4个F2代分离比没有达到显著水平外，其他杂交组合均达到显著水平，基本可以认定PSM4雄性不育性状分离比符合3∶1，为单隐性基因控制。

a. W10花药开裂纵切;b.W10花药开裂横切; c. W10花药开裂横切放大；d.PSM4花药横切; e. PSM4花药纵切图3 开花后1 d花药切片观察a. Longitudinal section of dehisced-anther of W10; b. Cross section of dehisced-anther of W10; c. Magnified views from b; d. Cross section of dehisced-anther of PSM4; e. Longitudinal section of dehisced-anther of PSM4Fig.3 Paraffin section of anthers of W10 and PSM4 in 1DPA

表5 2016年安阳F2代分离调查及χ2检验

亲本Parent指标IndexW10中棉所12 CCRI12中棉所19 CCRI19中99668 Zhong99668泗棉3号 Simian3新陆早12 Xinluzao12父本PSM4 PSM4 as male parent总株数 Number of plants211196234247188217不育株数 Number of sterile plant413447592643符合3∶1的χ2值 χ2 Chi-sequare of 3∶13.20*5.722.76*0.11*11.922.84*母本PSM4PSM4 as female parent总株数 Number of plants200231212194213189不育株数 Number of sterile plant424940384233符合3∶1的χ2值 χ2 Chi-sequare of 3∶11.50*1.57*3.932.75*2.89*5.34

3 讨 论

植物雄性不育基因可以是直接阻碍雄性发育的遗传因素，也可以是决定雄性发育需要某种生态条件的遗传特性[20]，因此在小麦[21-24]、棉花[16-17，25-26]、水稻[27-29]等作物花发育的过程中任何代谢受阻或不协调均会造成雄性不育。棉花组织培养是通过体细胞胚胎发生途径获得再生植株[30]，在组织培养过程能引起棉花染色体变异[31-32]。利用棉花组织培养引起的染色体变异可以创制新材料[33]。本研究在国际上首次应用棉花组织培养技术获得了一个光敏核雄性不育系品系。本研究再次证明了组织培养体系是一种创制突变体的有效途径。

PSM4与中国农业科学院棉花研究所早熟育种课题组通过航天诱变的芽黄光敏不育系‘中 9106 ’有着本质的区别[34-35]。‘中9106’[25]的芽黄标记，主要是子叶和真叶均表现为黄绿色，但随着叶片叶龄的增长，逐渐变绿，‘中9106’的黄化现象与PSM1、PSM2、PMS3有明显区别。‘中 9106 ’在光照周期为 13～14.5 h的长日照条件下表现不育，能配制杂交组合，生产杂交种；在光照周期为 11～12.5 h，日平均温度大于等于21.5 ℃的短日照条件下生长表现可育，可通过自交方式繁殖不育系。PSM4育性转变的光照时间为11.5 h，因此在中国全境，包括海南，夏季均可以作为不育系进行制种，海南的冬季可以自交繁殖。连续的阴雨天对PSM4光敏不育性状性无影响，例如2017年7月10日到8月2日，安阳仅有7月19日为晴天，PSM4没有观察到散粉和自交结铃现象。‘中9106’开花后花药干瘪塌陷，PSM4开花后花药在败育的时候仍表现为晶莹饱满，与正常棉花花药散粉前一样，花药室部位无塌陷。PSM4正常的花朵，十分适合利用昆虫进行杂交制种。

本研究利用棉花组织培养技术，经过大量再生植株的筛选，首次从中获得了光敏核雄性不育材料，首次证明了利用组织培养技术可以创造光敏不育突变体。创制的光敏不育材料PSM4来源于W10，W10来源于‘中棉所24’，曾经是中国黄河流域棉花主栽品种，具有优良的农艺性状，PSM4继承了‘中棉所24’的优良性状。PSM4在日照时间大于12 h的光周期下表现为雄性不育，在11.5～12 h光周期时表现为育性转变期，在小于11.5 h时表现为可育。因此可以利用两系法进行杂交制种。初步杂交试验表明，PSM4光敏不育基因为单基因隐性性状。总之，PSM4农艺性状优良，其光敏不育突变为隐性性状，所有的陆地棉品种(系)均为其恢复系，有利于杂交种的培育和棉花混选混交育种群体的建立，具有广阔的应用前景。