四川核桃良种SSR指纹图谱构建及遗传多样性分析

周于波，朱 鹏，龚 伟*，王景燕，闫思宇，吴开志

(1 四川农业大学 林学院, 林业生态工程四川省重点实验室，成都 611130; 2 四川省林木种苗站, 成都 610081)

核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃，胡桃科(Juglandaceae)核桃属(Juglans)植物，落叶乔木，与扁桃、腰果、榛子并称为世界著名四大干果[1]。核桃是中国传统果树，主要分布于中国云南、四川、新疆、贵州等地。四川是核桃种植大省，环境的多态性使四川核桃的种质资源十分丰富，形成了许多优良的地方品种。自20世纪60年代开始，四川陆续从新疆、辽宁、云南等地引进优良品种，但由于气候差异过大，北方和云南核桃品种在四川独特的生态环境中表现出环境适应性不佳，落花落果严重等问题[2]。基于此，育种工作者[2-5]利用云南的优良品种与适应于四川气候的乡土品种杂交获得了一批早实优良核桃品种，即‘川早’系列。近年来，越来越多的核桃品种通过四川省林木品种审定委员会的审(认)定并投入到生产中[6]，但在品种多样化的同时，由于核桃嫁接技术的成熟和核桃苗木时期无法通过表型将亲缘关系较近的品种区分开等原因，核桃品种在引种和推广过程中“同物异名”或“同名异物”的情况时有发生。另外，由于缺乏准确有效的苗木鉴定方法，也导致许多劣质种苗以次充好流入市场，不仅严重影响了良种持有人和种植户的利益，也严重影响了核桃产业的健康发展。因此，建立一种有效的苗木品种鉴定的方法，对保证核桃种苗质量和促进核桃产业发展尤为重要和迫切。

DNA分子标记是一种新兴的标记技术，包括限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、表达序列标签(EST)、扩增片段多态性(AFLP)、简单重复序列标记(ISSR)、简单重复序列(SSR)、单核苷酸多态性(SNP)等都已广泛应用于遗传图谱绘制、杂交子代纯度鉴定和遗传多样性评价等方面[7]。其中SSR标记以其多态性高、共显性遗传、重复性好等特点已经逐渐应用于果树的遗传多样性[8-10]、指纹图谱构建[11-12]、亲缘关系[13]等方面的研究。近年来，SSR标记在核桃方面的应用主要集中在核桃居群遗传结构分析[14-15]、新型SSR标记的开发[16-17]等方面，而在核桃优良品种指纹图谱构建方面的研究较少，具体运用到地方品种间的鉴定来指导生产实践的研究更是鲜见报道。鉴于此，本研究采用SSR标记对四川地区29个核桃良种进行分析，构建核桃品种指纹图谱，分析品种间遗传多样性和亲缘关系，以期为核桃良种资源的鉴定和后续新品种的选育与审(认)定提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

试验材料为四川省林木品种审定委员会审(认)定的29个核桃良种(表1)，包括四川本地选育的本地类型核桃品种18个(编号1～18)、杂交类型‘川早’系列5个(编号19～23)，经过引种驯化的北方类型核桃品种5个(编号24～28)、云南类型品种1个(编号29)。29个核桃品种叶片于2017年4月上旬采自于四川农业大学崇州基地，采样时选择新抽生的较嫩叶片，采集前用无水乙醇清洗消毒，采集后装入自封袋中，再放入冰盒中带回实验室备用。

1.2 方 法

1.2.1基因组DNA的提取采用宝生物植物DNA提取试剂盒(TaKaRa, Dalian)提取核桃基因组DNA。提取的DNA利用1%琼脂糖凝胶电泳检测质量、超微量核酸蛋白测定仪(Nanodrop-2000)测定DNA浓度，将合格样品浓度稀释到25 μg/mL后放入-80 ℃冰箱内备用。

1.2.2SSR扩增参考史丽会等[18]选用的扩增效果较好且稳定的11对SSR引物(表2)应用于试验中29个品种的PCR扩增。荧光引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。SSR-PCR反应体系为 25 μL，其中2 ×EsTaqMaster Mix(成都晶瑞思生物科技有限公司) 12.5 μL，Primer F和R引物(10 nmol·L-1)各1 μL，模板DNA(约25 ng·L-1)2 μL，最后用dd H2O补充至25 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55～60℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR产物送至成都擎科梓熙生物技术有限公司进行毛细管电泳分型分析。

1.2.3数据处理利用GeneMapper 4.0软件对得到的原始数据进行分析并获得扩增片段大小，获得的数据再根据GenAlEx 6.5软件格式进行转换后，计算每个位点的基因型数(Ng)、观察等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和香农信息指数(I)；利用PIC计算程式(PIC-calc)计算多态性信息含量(PIC)。将扩增片段数据转换成0、1二元数据，采用NTSYS-pc 2.1计算 Dice 遗传相似性系数并进行 UPGMA(非加权组平均法)聚类分析，绘制亲缘关系树状图。

表1 核桃品种名称及选育来源

注：①原名‘辽核1号’；②原名‘香玲’；③原名‘辽核4号’；④原名‘新新2号’；⑤原名‘云新高原’

Note: ① original name ‘Liaohe 1’; ② original name ‘Xiangling’; ③ original name ‘Liaohe 4’; ④ original name ‘Xinxin 2’; ⑤ original name ‘Yunxingaoyuan’

2 结果与分析

2.1 SSR扩增结果及遗传多样性

利用11对SSR荧光引物对29个核桃品种进行扩增，扩增结果见表3。11对引物共检测到80个等位基因，121个基因型，各引物等位基因数在5～12之间，基因型数在8～14之间，平均每对引物观测等位基因数和基因型数分别为7.273和11个；有效等位基因数为2.499～4.485，均值为3.644；观测杂合度为0.379～0.828，均值为0.645；期望杂合度为0.600～0.777，均值为0.718；香农信息指数为1.171～1.859，均值为1.518；多态信息含量为0.560～0.750，均值为0.680。SSR引物均为高多态性引物(PIC> 0.5)，说明选用的SSR引物能够较好地用于四川核桃品种遗传多样性分析。

表2 11对SSR引物信息

表3 11对SSR引物扩增结果及多态性信息

2.2 核桃遗传图谱

构建林木品种DNA指纹图谱比较常用的方法是引物组合法，即通过利用尽量少的引物组合来鉴别尽量多的品种，以达到简单经济的目的。当引物的PIC大于0.5时，表明采用的引物多态性较高、可供信息性较强。试验中选用的引物均为高多态性引物(PIC> 0.5)，均可作为指纹图谱的核心引物，但为使指纹图谱不冗余，利用最少引物组合将全部品种分开，试验综合各项指标分析，最终选择等位基因数、基因型数较多，PIC较大的wga001、wga032和zmz22共3对引物的扩增片段大小构建29个核桃品种的指纹图谱(表4)。表中以引物名称加上扩增片段大小作为品种的“指纹”，如‘薄壳早’在wga001位点的扩增片段大小为184和188 bp。由表4可以看出，29个核桃品种的指纹图谱互不相同，可用于后续品种的辅助鉴定。

2.3 遗传相似性分析

利用NTSYS-pc2.1进行遗传相似系数计算，计算结果显示29个核桃品种间的相似系数在0.580～0.914之间，平均为0.731。将品种间遗传相似系数分为0.500～0.599、0.600～0.699、0.700～0.799、0.800～0.899、0.900～0.999等5个区间并进行统计。由图1可知，遗传相似系数在0.900～0.999区间的有1对(‘盐源早’和‘薄壳早’)，为0.914；遗传相似系数在0.500～0.599区间的有4对，其中最小的1对为0.580(‘清香’和‘客龙早’)；29个核桃品种间的遗传相似系数分布在0.700～0.799区间的最多，在0.600～ 0.699区间的次之，在0.800～0.899区间的较少；且在区间0.600～0.699和0.700～0.799的占到总数的86.9%，说明29个核桃品种间大多数亲缘关系较近，且大多数品种间的相似系数变幅只有0.2，遗传基础相对较窄。

表4 各核桃品种的指纹图谱

图1 29个核桃品种间遗传相似系数区间Fig.1 Genetic similarity coefficient range of 29 walnut cultivars

2.4 聚类分析

29个核桃品种间遗传相似系数为0.580～0.914，平均为0.731。其中来自阿坝州黑水县的品种‘客龙早’和北方引种的‘清香’核桃遗传相似系数最小，为0.580，亲缘关系最远；来自阿坝州黑水县的‘薄壳早’和来自凉山州盐源县的‘盐源早’遗传相似系数最大，为0.914，亲缘关系最近。对29个核桃品种进行UPGMA聚类结果如图2，对聚类结果进行Cophenetic相关性检验发现，相关系数r= 0.727，表明聚类结果较好。以遗传相似系数0.66为阈值，29个核桃品种可分为2个类群，其中从云南引种的‘蜀江2号’单独聚为1个类群(Ⅱ)，另外28个品种聚为1个类群(Ⅰ)，表明云南类型品种‘蜀江2号’与其他类型的品种间亲缘关系较远。以遗传相似系数0.73为阈值，可以将第Ⅰ类群分为6个组；a组包括‘巴山乌米籽1号’、‘通核0147’、‘青川1号’、‘南核1号’、‘威薄01’、‘石坎紫皮’、‘梓森早核’、‘蜀苑4号’、‘珍珠核桃’、‘通核0114’、‘南核1号’、‘通核0046’共12个四川本地类型品种及‘川早1号’、‘川早2号’和‘蜀玲’共3个杂交类型核桃品种；b组包括‘客龙早’、‘通核0035’和‘蜀苑3号’共3个本地类型品种及‘林萍-1’和‘川香’共2个引自北方类型品种；c组包括2个亲缘关系最近的本地类型品种‘薄壳早’和‘盐源早’；d组引自北方类型品种‘川核早’单独聚为1组；e组包括2个引自北方类型品种‘南福1号’和‘清香’及1个本地类型品种‘七曲山核桃’；f组包括2个杂交类型品种‘双早’和‘早丰’。总体来看，29个核桃品种根据品种类型优先聚类，即第Ⅰ类群的a、c组主要是四川本地类型核桃，b、d、e组主要是北方引进品种，f组是2个杂交类型品种单独聚类，第Ⅱ类群的云南核桃单独聚类；四川本地类型品种的聚类结果表现出与地理来源没有明显的相关性。

图2 基于SSR标记的29个品种的UPGMA聚类图Fig.2 Clustering figure (UPGMA) of 29 walnut varieties based on SSR markers

3 讨 论

中国核桃产业的发展最严重的问题之一是品种混杂[19-20]。目前，中国核桃品种的鉴定领域仍然是以表观性状与经济性状为主，其中以2011年制定的《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南——核桃属》标准最具权威性。但在品种多样化的同时，有些亲缘关系较近的核桃品种仅靠表型性状很难准确区分，因此能够反映植物DNA水平变异且具有多态性、高效性等特点的SSR分子标记已逐渐运用于核桃的品种鉴定研究中[21]。陈凌娜[22]利用12对SSR引物对35个北方主栽核桃品种进行了DNA分型分析发现，12对引物的PIC含量变幅为0.53～0.87，平均为0.73，4对引物结合就能将供试的35个品种分开，充分体现了SSR标记用于鉴定的高效性。本研究中，11对多态性引物对四川29个核桃品种扩增结果显示，仅使用其中3对SSR引物组合(wga001、wga032、zmz22)即可将29个核桃品种完全分开，引物的可鉴定性较强。另外，本研究所采用的11对引物均为高多态性引物(PIC> 0.5)，可供信息性较强，可运用于以后的四川核桃遗传多样性研究。

基于11个SSR标记的聚类分析结果显示，29个核桃品种根据品种类型优先聚类，第Ⅰ类群的a组基本上是四川本地的乡土核桃品种，还包括‘川早1号’、‘川早2号’和‘蜀玲’3个杂交类型核桃品种。这一结果与高源等[23]和张瑞萍等[24]利用SSR技术对苹果种质资源亲缘关系分析中栽培品种和当地品种及野生品种聚在一起的情况类似。这可能与3个杂交核桃品种的父本是四川本地的核桃品种[2]，携带的四川本地核桃血统较多有关。b组、d组主要是从北方引进的核桃品种，而‘客龙早’、‘蜀苑3号’、‘通核0035’和‘七曲山核桃’4个乡土核桃品种与其聚在一起，亲缘关系较近，可能与四川引进北方品种历史较长，本地核桃与北方核桃进行了广泛的基因交流，而这几个品种可能是从北方核桃与本地核桃种质资源自然杂交后代中选育出来的有关。f组的2个杂交核桃品种聚为1组，亲缘关系较近，可能是‘双早’和‘早丰’的父本和母本都一致的缘故，而母本相同的‘川早’系列的5个品种没有完全聚在一起，可能是因为‘川早’系列的父本是本地核桃，母本是‘云南云新’系列[2-5]，两者的遗传关系较远，子代间存在一定的遗传分化。本研究还发现，四川本地核桃品种的聚类结果与选育的地理来源没有直接的相关关系：来源相同且亲缘关系较近的品种只有1对，即来自绵阳的‘梓森早核’与‘石坎紫皮’；亲缘关系最近的‘薄壳早’和‘盐源早’地理选育来源较远；还有一部分来自同一选育来源地的几个品种分散在几个组中。这与张明泽等[25]对黔南茶树种质资源的研究结果类似，可能与四川核桃广泛引种交流导致一部分优良基因在不同地区渗入有关[25-27]。

遗传相似系数是判断品种间亲缘关系及遗传基础的标准之一。遗传相似系数越大，亲缘关系越近，遗传相似系数的变幅越大，供试材料的遗传基础越宽[27-28]。本研究中29个核桃品种间遗传相似系数为0.580～0.914，变幅为0.334，且处于0.600～0.799区间内的占到86.9%。因此，供试的29个品种亲缘关系较近，遗传基础相对较窄。这与陈良华等[29]对四川核桃遗传多样性研究得出的四川4个野生核桃群体的遗传相似性较大的研究结果相似。本研究还发现，母本和父本都相同且遗传距离较远的四川乡土核桃品种和云南核桃杂交的‘川早’系列(‘川早1号’、‘蜀玲’、‘早丰’)在聚类时并未聚在一起，而且遗传相似系数相对较小，遗传变异较大，杂种优势较强。因此，建议以后四川核桃品种选育多利用杂交育种方法，并尽量选择遗传距离较远的亲本。