黑穗醋栗叶片衰老过程中抗坏血酸含量及相关酶活性的变化特征

刘庆帅，孙小娟，谢禛名，郭良川，霍俊伟，秦 栋

(东北农业大学 园艺园林学院，寒地小浆果开发利用国家地方联合工程研究中心，哈尔滨150030)

植物在正常代谢过程中会产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，一定浓度的ROS是植物正常的生理过程中必不可少的，但一旦过量就会对细胞造成损伤，引起植物未成熟衰老和死亡，而在植物生长发育过程中积累大量的生物氧自由基，可通过抗氧化系统清除[1]。抗坏血酸(ascorbic acid，AsA)，亦称维生素C，是植物和大多数动物体内合成的一类己糖内酯化合物，作为植物体内重要的抗氧化剂和酶的辅因子，可通过一系列氧化还原反应来直接清除H2O2。同时，AsA不仅参与植物细胞分裂增殖、细胞壁代谢与细胞膨大[2]，而且在对维持植物光合作用、代谢调控[3]、提高植物抗逆性[4]、参与激素合成与信号转导[5]和影响开花时间和衰老[6]等方面发挥着重要作用。另外，AsA也是人类正常生长发育所必需的化合物，但是人类及部分高等灵长类动物自身由于缺乏关键酶而不能合成AsA，所以人体所需AsA必须从食物中获得，而蔬菜和水果中含有丰富AsA，是人体摄取AsA的主要来源。

黑穗醋栗(RibesnigrumL.)属虎耳草科(Saxifragaceae)茶藨子属(Ribes)落叶丛生灌木，果实营养丰富，其AsA含量高达11.36～22.73 μmol/g[7]，仅次于猕猴桃[8]，其AsA含量高于大多数水果，与越橘、树莓和沙棘等一起被称为“第三代”新型水果，是很有发展前景的天然食物资源。高水平的AsA作为黑穗醋栗的重要品质，其AsA合成和代谢的研究对黑穗醋栗的品质发育具有重要影响。目前对黑穗醋栗果实AsA代谢已经有了较为深入的系统研究，但对其叶片生长发育过程中AsA合成代谢调控机制及品种叶片AsA含量与其果实中AsA含量关系尚不清楚。本课题组前期研究发现[9-11]，黑穗醋栗叶片中AsA含量比果实还要高，不仅可以直接提取，还可以将叶片烘烤制成独特的“黑穗醋栗茶”，另外黑穗醋栗枝叶也是提取珍贵香料的原材料。

现有研究表明叶片衰老是植物生长发育不可分割的一部分，是叶片发育的最后阶段。叶片的衰老除了自身生长发育的原因外，还有环境等其他因素，比如病虫害、环境胁迫等也会引起叶片的衰老[12]。目前对植物处于胁迫条件下的抗氧化代谢研究较多，而对自然衰老过程的植物抗氧化代谢研究很少[13]，近年来研究表明，AsA还参与植物的衰老调控[14]。因此研究叶片衰老与植物体内抗氧化防御系统的关系，对提高作物对氧化胁迫的抗性有着十分重要的意义。目前对黑穗醋栗叶片衰老过程中AsA积累特征的研究还鲜有报道。

研究植物自身AsA合成代谢规律，寻找植物不同品种或不同发育时期AsA代谢特点，对进一步研究AsA在植物体内的功能及其水平调控具有重要的意义。因此，本试验以3个不同黑穗醋栗品种的叶片为材料，研究叶片衰老过程中AsA代谢的规律，以揭示叶片生长发育及自然衰老过程中AsA含量与代谢合成相关酶之间的关系，最终为寻找黑穗醋栗最佳叶片采摘时期、AsA含量的调控及延缓叶片衰老进程提供理论基础，也为验证品种叶片AsA含量与其果实中AsA含量相关性奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为同一生长地点的3个不同黑穗醋栗主栽品种‘亚德列娜亚’(以下均简称‘亚德’)、‘布劳德’和‘黑丰’，其中‘亚德’为早熟丰产大果俄罗斯品种，‘布劳德’为中晚熟大果丰产波兰品种，‘黑丰’为晚熟小果中国品种，均为10年生成龄小浆果果树，生长良好，枝叶量大，常规管理，在整个生长期所有田间管理与当地果园一致，定植于东北农业大学的黑穗醋栗种质资源圃。于2017年4月27日挂牌标记生长健壮的植株上生长一致的阳面外围春梢顶端新生叶片，即当幼叶长到0.5 cm长时开始计算叶龄。自叶龄为10 d起，每隔7～10 d采取生长一致的叶片若干为试材，共采样8次，直至叶片衰老为止，采后的叶片立即投入液氮并带回实验室，放入-80 ℃冰箱备用，进行后续各项指标测定。采取的黑穗醋栗不同时期叶片从幼叶期到衰老叶期分别标记为幼叶期(S1～S2)、展开叶期(S3～S4)、成熟叶期(S5～S6)、衰老叶期(S7～S8)(图1)。

1.2 指标测定

还原型抗坏血酸(AsA)、氧化型抗坏血酸(DHA)、还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量的测定试剂盒及脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、谷胱甘肽还原酶(GR)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶(GalLDH)活性的测定试剂盒均购于苏州科铭生物技术有限公司，按照说明书进行提取、测定。其中总抗坏血酸(T-AsA)含量为AsA与DHA之和，总谷胱甘肽(T-GSH)含量为GSH与GSSG之和。过氧化氢(H2O2)含量测定试剂盒为武汉纯度生物科技有限公司产品，按照其说明书进行提取和测定。以上每项测定重复3次。

1.3 数据分析

用Excel 2007进行数据处理、作图，以SPSS 17.0软件进行相关分析。

S1～S8代表叶片的不同发育时期(S1～S2.幼叶期；S3～S4.展开叶期；S5～S6.成熟叶期；S7～S8.衰老叶期)。下同图1 黑穗醋栗不同品种叶片衰老过程中形态变化S1-S8 represent different developmental stages of the leaves(S1-S2.Young leaf；S3-S4.Full leaf；S5-S6.Mature leaf；S7-S8.Senescent leaf); The same as belowFig.1 Morphological changes in different varieties of black currants during leaf senescence

2 结果与分析

2.1 各品种黑穗醋栗叶片衰老过程中AsA、DHA及T-AsA含量的变化特征

在黑穗醋栗叶片生长、发育、衰老过程中，叶片单位鲜重的抗坏血酸(AsA)含量在生育期之间存在显著的差异；各品种叶片AsA、氧化型抗坏血酸(DHA)及总抗坏血酸(T-AsA)含量均表现出先增加后减少的变化趋势，但DHA变化幅度较小(图2，Ⅰ～Ⅲ)。首先，‘亚德’、‘布劳德’和‘黑丰’品种叶片的T-AsA含量在幼叶时期(S1)都比较低，依次为37.54、33.71和32.88 μmol/g；各品种叶片T-AsA含量均在叶片成熟时期(S6)达到最高水平，它们依次为115.33、82.24和62.98 μmol/g，此时叶片已经达到成熟；各品种叶片T-AsA含量在衰老叶期(S8)降到最低，其含量依次为44.32、35.01和30.83 μmol/g，分别仅为叶片成熟期(S6)的38.42%、42.57%和48.95%。其次，3个品种叶片AsA含量在初叶期含量也较低，之后随着叶片的生长发育迅速上升，并在叶片成熟期(S6)达到峰值，此时‘亚德’叶片的AsA含量最高，‘布劳德’次之，黑丰较低，其含量依次为98.33、68.17和44.94 μmol/g，分别是幼叶时期(S1)的6.23、6.02和5.09倍。同时，叶片成熟期(S6)时，‘亚德’叶片AsA含量要比‘黑丰’高出2倍多，这进一步证实了黑穗醋栗品种叶片AsA含量具有多样性。再次，DHA是AsA的可逆的氧化型，在生物体内与抗坏血酸共同组成氧化还原系统，具有电子受体的作用。对于黑穗醋栗叶片中DHA含量而言，3个品种DHA含量在幼叶时期(S1～S2)均相对较高，之后随叶片的衰老不断下降，至衰老叶时期(S8)时降到最低值，总体来说DHA含量在叶片衰老过程中一直呈降低趋势，但变化不明显(图2，Ⅲ)。

A.亚德；B.布劳德；C.黑丰；误差线表示标准偏差；同一品种内不同小写字母表示在0.05水平差异显著。下同图2 黑穗醋栗不同品种叶片衰老过程中T-AsA、AsA和DHA含量的变化A. Adelinia; B. Brodtrop; C. Heifeng; Error bars indicate standard deviation; The different normal letter in the same variety showed significant difference at 0.05 level. The same as belowFig.2 Changes of T-AsA, AsA and DHA contents in different varieties of black currants during leaf senescence

2.2 各品种黑穗醋栗叶片衰老过程中GSH、GSSG及T-GSH含量的变化特征

谷胱甘肽(GSH)是植物体内另一个重要的抗氧化剂和氧化还原势的调节剂，作为DHA的电子供体，其氧化还原态是通过AsA-GSH循环来与AsA联系的。首先，3个品种黑穗醋栗叶片总谷胱甘肽(T-GSH)含量相差不大，但在叶片不同生长阶段中，GSH的水平表现出明显的差异(图3，Ⅰ～Ⅱ)。3个品种叶片T-GSH含量从幼叶期(S2)迅速上升，至展开叶时期(S3～S4)上升到最高值，此时‘亚德’叶片T-GSH含量最高，为1.10 μmol/g，是‘布劳德’和‘黑丰’的1.09倍和1.41倍，之后随叶片的衰老而迅速降低。同时，3个品种叶片GSH含量与T-GSH含量变化趋势一致，均是随着其叶片生长进程呈现先逐渐增加后降低的趋势，均在展开叶初期(S3)或展开叶时期(S4)中达到最大，之后随着叶片的生长发育而逐渐降低，至衰老叶时期(S8)中下降幅度最大；‘亚德’、‘布劳德’和‘黑丰’叶片GSH含量峰值分别为1.07、0.86和0.77 μmol/g，分别是衰老叶时期(S8)的3.63、4.75和4.85倍。

图3 黑穗醋栗不同品种叶片衰老过程中T-GSH、GSH和GSSG含量的变化Fig.3 Changes of T-GSH, GSH and GSSG contents in different varieties of black currants during leaf senescence

另外，在叶片衰老过程中，3个品种叶片GSSG含量在幼叶初期(S1)较高，幼叶期(S2)后有所下降，但下降幅度不明显，之后有所回升；叶片成熟后，GSSG含量随着叶片的衰老再次显著降低，并到衰老叶时期(S8)降至最低值(图3，Ⅲ)，此时‘亚德’、‘布劳德’和‘黑丰’叶片GSSG含量分别仅为幼叶时期(S1)的39.53%、22.05%和31.11%。

2.3 各品种黑穗醋栗叶片衰老过程中AsA-GSH氧化还原程度的变化特征

AsA/DHA的大小代表了AsA氧化还原程度的高低，比值越高，则还原态的AsA含量越高，对AsA的积累越有利。3个黑穗醋栗品种叶片中AsA/DHA比值变化趋势相似，均随着叶片衰老过程呈先升高后降低的趋势(图4，Ⅰ)。其中‘亚德’叶片中AsA/DHA比值高于其他两个品种，说明‘亚德’叶片中AsA氧化程度较高。在幼叶生长阶段(S1～S2)，各品种AsA/DHA比值无明显变化；之后，随着AsA氧化还原程度不断提高于叶片成熟期(S6)达到最高，此时‘亚德’、‘布劳德’和‘黑丰’的AsA/DHA比值依次为5.78、4.84和2.19，分别为幼叶时期(S1)的7.98、9.56和5.96倍；然后，随着叶片的衰老，各品种叶片AsA/DHA比值显著降低，说明抗坏血酸氧化还原状态与叶片的衰老密切相关。

同时，GSH/GSSG比值用来衡量谷胱甘肽氧化还原状态，通常使用GSH/GSSG比值变化来反映AsA-GSH循环在AsA生成中所起重要作用。GSH/GSSG越高意味GSH量越高，同时表明有越多DHA可通过DHAR和GSH作用转化为AsA。在黑穗醋栗叶片整个生长发育时期，GSH/GSSG比值在3个品种叶片中均呈现相似的“M”型的变化模式(图4，Ⅱ)，即表现出先上升后下降再上升再下降的趋势。从品种间来看，‘亚德’叶片GSH/GSSG比值明显要高于同期另外两个品种。叶片由展开叶时期进入到成熟叶时期时，其GSH/GSSG比值剧烈下降，说明此时的GSH含量有下降趋势，合成能力占据上风，再生能力有所减缓；在展开叶时期(S3～S4)和成熟叶时期(S5～S6)，各品种叶片GSH/GSSG比值均有两个峰值，之后随着叶片的逐渐衰老而迅速降低。

图4 黑穗醋栗不同品种叶片衰老过程中AsA/DHA和GSH/GSSG比值的变化Fig.4 Changes of AsA/DHA and GSH/GSSG ratios in different varieties of black currants during leaf senescence

2.4 各品种黑穗醋栗叶片衰老过程中GalLDH和AsA-GSH循环代谢相关酶活性的变化特征

2.4.1GalLDH活性GalLDH作为AsA主要合成途径L-半乳糖途径中最后一个关键酶，在很大程度上对AsA的生物合成起着调控作用。在黑穗醋栗叶片整个生长发育过程中，3个品种叶片GalLDH活性变化趋势相同(图5)。在叶片发育初期，各品种叶片GalLDH活性相对较高，这也是叶片内AsA含量迅速积累的时期；GalLDH活性从幼叶到成熟叶时期(S1～S6)过程中明显上升，并均在成熟叶时期(S5)达到峰值；之后随叶片的衰老，叶片GalLDH活性显著下降，这与各品种叶片T-AsA和AsA含量的变化趋势基本一致。其中，在成熟叶时期(S5)时，此时‘亚德’、‘布劳德’和‘黑丰’叶片GalLDH活性峰值分别为20.35、16.42和10.69 μmol·min-1·g-1，‘亚德’分别为‘布劳德’和‘黑丰’的1.24倍和1.90倍。从品种间来看，不同发育时期‘亚德’叶片GalLDH活性均高于其他两个品种。

2.4.2AsA-GSH循环代谢相关酶活性3个黑穗醋栗品种叶片衰老过程中DHAR和MDHAR活性总体变化趋势基本一致，均是先增加后降低(图6，Ⅰ～Ⅱ)。3个品种叶片的DHAR活性在幼叶期(S1)均相对较低；之后迅速上升，‘亚德’叶片中DHAR活性在展开叶初期(S3)达到峰值(0.29 μmol·min-1·g-1)，而‘布劳德’和‘黑丰’DHAR活性均在展开叶时期(S4)达到最高，分别为0.54和0.61 μmol·min-1·g-1；随后，各品种DHAR活性均随着叶片衰老而降低，在衰老叶时期(S8)降到最低，衰老叶时期(S8)活性分别比展开叶时期(S4)下降了58.65%、59.57%和53.56%。同时，3个品种叶片的MDHAR活性均在展开叶初期(S3)达到最高值，分别为0.15、0.11和0.15 μmol·min-1·g-1，并在衰老叶时期(S8)降到最低；3个品种展开叶初期(S3)叶片的MDHAR活性分别为其衰老叶时期(S8)的6.06、6.62和7.20倍。相比较DHAR活性大小，3个品种不同生育时期叶片中MDHAR活性均低于DHAR活性。

图5 黑穗醋栗不同品种叶片衰老过程中GalLDH活性的变化Fig.5 Changes of GalLDH activity in different varieties of black currants during leaf senescence

在叶片的整个生长发育阶段，3个黑穗醋栗品种叶片的GR活性在展开叶时期(S4)最高，在衰老期(S8)降至最低(图6，Ⅲ)。其中，从幼叶至展开叶时期(S1～S4)，3个品种GR活性随着叶片的成熟而增加，之后其活性逐渐下降，‘亚德’、‘布劳德’和‘黑丰’在衰老叶时期(S8)叶片GR活性仅为展开叶时期(S4)的28.08%、32.34%和15.02%；3个品种叶片GR活性在展开叶时期(S4)后都要高于同期MDHAR活性，说明在黑穗醋栗叶片生长后期GR对叶片影响较大。

2.4.3APX活性AsA-GSH是AsA再生的主要系统，在该系统中，APX是植物AsA-GSH氧化还原途径的重要组分，且是清除H2O2，特别是叶绿体中H2O2的关键酶。在黑穗醋栗叶片的整个生长发育过程中，3个品种叶片APX活性变化趋势基本一致(图6，Ⅳ)。在幼叶时期(S1)后，各品种叶片APX活性随叶片叶龄的增长而逐渐增加，之后随着叶片的衰老而降低，且APX活性明显高于同期DHAR、MDHAR和GR活性(图6，Ⅰ～Ⅳ)。其中，‘黑丰’、‘亚德’、‘布劳德’叶片APX活性均在成熟叶时期(S5)达到最高值，均在衰老叶时期(S8)中活性降到最低值，它们叶片APX活性最高值分别为3.32、2.97和1.39 μmol·min-1·g-1，最低值比最高值分别下降了78.82%、78.54%和77.81%。叶片APX活性的降低有助于确保AsA含量的积累与稳定。

2.5 各品种黑穗醋栗叶片衰老过程中H2O2含量的变化特征

H2O2是对植物具毒害作用的活性氧，是体内及体外光合电子传递链的天然产物。同时H2O2可能是启动叶片衰老的一个重要因子。3个黑穗醋栗品种叶片H2O2含量在叶片发育过程中的变化趋势相一致，均是随着叶龄的增加而呈逐渐上升趋势，并且这3个品种之间H2O2含量差别也很小(图7)。其中，从幼叶时期到展开叶时期(S1～S4)，生育期之间H2O2含量差异不大；在成熟叶时期(S5)，‘亚德’、‘布劳德’和‘黑丰’叶片H2O2含量分别为1.32、1.39和1.03 μmol/g，比相应幼叶时期(S1)分别上升了39.02%、58.58%和43.22%；而到了衰老叶时期(S8)，各品种叶片中H2O2含量均达到最高值，分别为相应幼叶时期(S1)H2O2含量的2.75、4.33和3.74倍。可见，黑穗醋栗叶片的衰老可能与叶片中H2O2的大量积累有密切联系；同时，由于H2O2的清除需要APX以AsA作为电了供体，因此推测黑穗醋栗衰老叶片H2O2的大量积累可能与AsA含量、APX活性降低有关。

图6 黑穗醋栗不同品种叶片衰老过程中DHAR、MDHAR、GR和APX活性的变化Fig.6 Changes of DHAR, MDHAR, GR and APX activities in different varieties of black currants during leaf senescence

图7 黑穗醋栗不同品种叶片衰老过程中H2O2含量的变化Fig.7 Changes of H2O2 content in different varieties of black currants during leaves senescence

2.6 黑穗醋栗叶片衰老过程中AsA合成代谢相关指标间的相关性

黑穗醋栗品种‘亚德’叶片衰老过程中相关酶活性和叶片中AsA含量相关性分析结果如表1所示，另外两个品种与‘亚德’类似，故不全部列举。结果表明，在‘亚德’叶片生长发育过程中，GSSG含量与T-AsA、AsA和DHA含量呈显著正相关；GSH/GSSG与T-AsA和AsA含量呈显著负相关，而与GSSG含量存在极显著负相关。GalLDH活性与T-AsA、AsA、DHA含量和DHAR、MDHAR活性呈现极显著的正相关，而与T-GSH和GSSG含量呈显著正相关，与AsA/DHA、GSH/GSSG显著负相关，即叶片中GalLDH活性越高，叶片中AsA含量也越高，说明GalLDH可能是AsA合成关键酶。同时，在AsA-GSH循环代谢相关酶中，DHAR活性与T-AsA、AsA和DHA含量以及MDHAR均呈极显著正相关。GR活性与GSSG含量呈显著正相关，与GSH/GSSG呈显著负相关，GR活性随GSH含量升高而降低，可能存在GSH对GR的反馈抑制。而APX活性与其他指标相关性均不显著。

3 讨 论

植物衰老是由内部因素控制，在植物生长发育的不同阶段都可以发生，受外部因素影响导致植物自然死亡的一系列衰退过程，对发育生物学有着重要的作用[15]。在植物进入衰老时期时，会产生大量的自由基，而植物体内的活性氧(ROS)消除系统的活性下降，就会使植物自由基的产生、消除平衡受到破坏。近年来研究表明，作为植物非保护酶系统的重要组分，AsA在清除活性氧自由基及抗氧化方面具有非常重要的生理功能，植物体内较高的AsA水平将有助于提高抗逆境胁迫的能力。它可以直接清除一些活性氧自由基，并通过AsA-GSH循环来间接清除H2O2，减轻其对植物的伤害[16-17]。H2O2被认为是一种导致植物氧化胁迫的活性氧分子和植物细胞应答环境变化所产生的重要信号分子[18]。叶片是植物进行光合作用的主要器官，其生长状况的好坏直接影响着光合作用的效率和光合产物的积累，进而影响产量。生长旺盛的叶片，其内部各种生理代谢协调，尤其是活性氧的产生与清除系统之间的平衡，该平衡系统调控着叶片的衰老与否。本研究结果表明，在黑穗醋栗叶片生长发育过程中，随着叶片的衰老，H2O2的含量不断增加，并在衰老期(S8)达到最高，在苹果[1]、玉米[19]和水稻[20]等植物中叶也有相同的研究结果。H2O2含量增加导致以AsA为核心的代谢相关酶活性迅速增强，AsA及AsA库含量也逐渐增加，同时APX活性增强，AsA参与H2O2的清除被大量消耗，而其最终产物DHA含量随着叶片叶龄的增加下降幅度很小，致使AsA/DHA比值快速降低。

AsA是植物生长发育所必需的物质，不同物种间其含量差异很大，即使同一物种不同品种间AsA含量也存在差异，甚至在同一植物的不同组织器官AsA含量也有所不同[21]。目前研究表明很多植物的绿色光合组织器官中AsA含量比果实还高，可能是这些器官通常会产生更多的活性氧物质，需要更高含量的AsA来处理。如双子叶模式植物拟南芥叶片的AsA含量为5 μmol/g，单子叶模式植物水稻叶片的AsA含量为6 μmol/g。高山植物与温带常绿植物通常也有较高的AsA积累，比如高山植物的高山圆币草(Soldanellaalpina)叶片的AsA含量高达30 μmol/g，是陆地植物的5～10倍[5]。而黑穗醋栗也是这其中的一种，本试验结果表明，3个不同黑穗醋栗品种叶片AsA含量与T-AsA含量表现出相似的变化趋势，均是在成熟叶时期(S6)达到最高，之后随着叶片的衰老而下降，且在不同叶龄叶片中含量有显著差异；DHA含量随着叶片的衰老一直有所降低，并在衰老叶期(S8)降至最低；从而引起黑穗醋栗叶片中AsA/DHA在成熟叶期(S6)达到最高，之后随着叶片的不断衰老而下降。这与在苹果叶片衰老过程中相关研究结果类似，但与刺梨叶片衰老过程中相关研究结果存在一些差异[22]，这可能与物种不同有关。

AsA-GSH循环作为植物体内主要抗氧化系统，可以抑制活性氧的产生，在植物衰老过程中起着重要作用[23]。在本试验中，DHAR和MDHAR活性与AsA含量和AsA的氧化还原势变化趋势基本一致，说明DHAR和MDHAR活性对于维持AsA水平及氧化还原状态有着重要作用，同时也说明了DHAR和MDAHR活性是影响黑穗醋栗叶片AsA含量的决定因素之一。进一步相关性分析表明DHAR与MDHAR呈显著正相关，说明AsA循环再生酶可能随着一种酶活性的变化而相应变化，这与在柑橘[24]、苹果[1]中的研究结果相一致。随着黑穗醋栗叶片的成熟与衰老，叶中GSH含量和GR活性下降，而AsA含量也降低，表明GSH和GR有助于叶片中AsA的积累；而同时APX活性与AsA含量变化趋势基本相反，呈现此消彼长的趋势，另外，本研究中黑穗醋栗叶片APX活性明显高于同期其他酶活性，可有效防止活性氧(ROS)对细胞的毒害，这与在甜樱桃[25]中的研究结果相一致。AsA再生能力随叶片的衰老而下降，DHAR、MDHAR、GR活性的下降与AsA含量的下降相关，这说明可以通过增强再生酶的活性来提高植物AsA的积累[26]，调控其循环代谢过程，进而延缓植物衰老、增加植物抗逆性。比如，有研究表明过量表达GR不仅能提高GSH的水平而且可以增加AsA含量，还能提高植物对逆境的抗性，同时还发现GSH是一种有效的活性氧清除剂，能够延缓棉花叶片的衰老[27]，还能阻止离体水稻叶片的衰老[28]。

作为在L-半乳糖途径中的关键酶GalLDH，它的有无是植物是否能自身合成AsA的前提[29]，刺梨中AsA含量的积累与GalLDH活性存在着明显的正相关关系[30]，同样枣和酸枣中GalLDH活性与AsA含量存在一定的相关性[31]。本试验相关性分析发现‘亚德’叶片GalLDH活性与AsA含量的变化呈正相关，这与在梨[32]、马铃薯[33]中的研究结果相一致。研究发现，苹果不同叶龄叶片中GalLDH活性变化趋势与AsA含量的变化基本一致，且AsA含量主要依赖于AsA的生物合成，同时发现GalLDH对AsA合成有一定的调控能力[21]；马铃薯的GalLDH在不同器官中基因表达量变化与AsA含量的变化高度一致[34]；同样，GalLDH过量表达能显著提高烟草中AsA含量[35]。在本研究中，黑穗醋栗叶片GalLDH活性从幼叶时期到成熟叶时期(S1～S6)明显上升，之后随叶片的衰老显著下降，这与T-AsA和AsA含量的变化趋势基本一致，而且‘亚德’叶片GalLDH活性比另外两个品种要高，这也进一步证明了GalLDH活性的高低可能是影响黑穗醋栗品种间叶片AsA含量差异的重要原因，也就可以解释为何‘亚德’AsA含量比‘布劳德’和‘黑丰’高，进而可以推测GalLDH可能在AsA合成过程中起着关键性的作用。

综上所述，本试验发现黑穗醋栗叶片GalLDH活性变化趋势与其AsA含量变化一致，且GalLDH和DHAR活性与AsA含量存在显著的正相关关系，所以推测GalLDH和DHAR可能是黑穗醋栗叶片AsA合成代谢过程中的关键酶，可以通过提高其酶活性来提高叶片中AsA含量，进而延缓叶片衰老，达到增强植株抗性的目的，为后期黑穗醋栗叶片的开发利用及研究黑穗醋栗AsA积累机制提供依据。