不同耐铝型杉木幼苗叶片抗氧化系统对铝胁迫的响应特征

罗红艳，陈潇潇，石零珊，曹光球，林思祖，叶义全

(1 福建农林大学 林学院，福州 350002；2 国家林业局杉木工程技术研究中心，福州 350002)

杉木(Cunninghamialanceolata)是中国南方重要的速生用材树种之一，因其具有材质优良和速生丰产等特点被广泛种植，在中国林业生产中占据重要地位[1]。长期林业生产实践表明，铝毒是中国南方富铁铝化酸性土壤中限制杉木生长，导致杉木人工林产量下降的主要原因之一[2-3]。近年来，随着肥料的不合理使用、杉木连栽代数的增加以及全球酸沉降的加剧，南方林地土壤的酸化程度进一步加深[4-7]，从而极大地促进土壤中活性铝的释放，导致土壤中活性铝的含量显著增加，使杉木遭受铝毒害状况日益加剧。因此，选育具有耐铝能力的优良杉木家系，充分挖掘优良家系的遗传潜力，提高杉木对铝胁迫的耐性，是解决当前林地土壤铝毒害问题的有效途径之一，而探明杉木遭受铝毒和耐铝性的生理生化机制是开展杉木耐铝品种选育和遗传改良的基础。尽管近年来已有部分学者对杉木铝毒展开了研究，但大部分研究主要集中在铝毒胁迫对杉木的生长、养分吸收、有机酸分泌和SOD活性的影响等方面[3,8-13]，迄今对于杉木自身如何感知铝胁迫，并作出响应的调控机制仍知之甚少。因此，开展杉木铝毒胁迫耐性机制的研究，对于揭示杉木适应铝毒胁迫环境的生物学过程，并通过基因工程手段改良杉木耐铝能力，改善酸性土壤中杉木的生长，最终提高杉木人工林的产量具有重要理论和现实意义。

铝胁迫诱导的活性氧迸发及其介导的质膜氧化损伤被认为是铝胁迫引起植物生长受抑的主要原因之一[14]。正常情况下，植物体内活性氧的产生和清除处于稳态平衡状态，对植物并无害处，甚至可以作为一种有益的信号分子广泛参与植物各种生理过程的调控[15]。但在铝胁迫条件下，植物体内活性氧的大量迸发，会对质膜的结构和完整性造成严重破坏，从而引起氧化损伤，最终抑制植物对养分和水分的吸收[16]。植物为缓解铝毒胁迫引起的氧化损伤，在长期适应铝毒环境过程中进化出一套由酶促和非酶促抗氧化系统组成的活性氧清除体系。抗坏血酸-谷胱甘肽循环(AsA-GSH)作为植物抗氧化系统的重要组成部分，在调控植物体内活性氧水平，增强植物逆境胁迫耐性中扮演着重要角色[17-20]。目前关于AsA-GSH循环在铝胁迫[17]、重金属胁迫[18,20]、干旱胁迫[19]和低温胁迫[21]等非生物胁迫中的作用已得到证实，而且越来越多研究证实AsA-GSH酶活性与植物逆境胁迫耐性密切相关[22-24]。尽管目前关于植物耐铝机制的研究已有不少，但这些研究主要集中在农作物中[22-24]，而对杉木耐铝机制的研究较少[8]，特别是关于AsA-GSH循环在杉木耐铝性中的作用尚未见研究报道。因此，本研究以耐铝型(YX26)和铝敏感型(YX5)杉木家系为试验材料，考察铝胁迫对杉木叶片膜脂过氧化、抗氧化酶和AsA-GSH循环的影响，并进一步分析不同耐铝型杉木无性系对铝胁迫响应的差异，探讨抗氧化酶系统与杉木耐铝能力之间的相互关系，以期从AsA-GSH角度揭示杉木耐铝机理，并为利用基因工程手段改良杉木耐铝能力，改善酸性土壤上杉木的生长，从而最终提高杉木人工林产量提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试杉木家系材料是由国家林业局杉木工程技术研究中心提供的YX5和YX26一年生杉木苗。本课题组在前期试验中对包括杉木家系YX5和YX26在内的72个杉木家系进行苗期耐铝性的筛选，结果显示，YX26较耐铝，而YX5则对铝较为敏感。

1.2 试验设计

本试验于2016年4月中旬在福建农林大学田间实验室温室大棚进行。统一选用盆口内径40 cm、底部内径35 cm、高度33 cm的圆形塑料花盆开展盆栽试验，盆栽基质为蛭石和珍珠岩(2∶1,V/V)混合物。选取长势(苗高、地径)基本一致的1年生杉木家系YX5和YX26幼苗，先将其移栽入塑料花盆中缓苗10 d，每盆3株苗，缓苗结束后开始进行铝胁迫试验处理。本试验共设2个处理，分别为对照(CK)和铝胁迫(Al)，2个处理均设3次重复，每次重复共4盆。试验处理中对照用Hoagland营养液浇灌，铝胁迫处理用Hoagland营养液再加AlCl3溶液浇灌，铝浓度为1 mmol·L-1，营养液pH均为4.5。试验期间每天定时向每盆中浇0.2 L相应营养液1次，处理10 d后，用消毒处理的剪刀剪取杉木幼苗上部高度一致的当年生枝条尖端的无病无斑、完全展开的新生叶，立即置于自封袋于液氮中速冻，并置于-80 ℃冰箱保存，用于后续相关生理指标的测定。

1.3 测定指标与方法

试验采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定杉木幼苗叶片丙二醛(MDA)的含量[25]。采用愈创木酚法[27-28]测定杉木幼苗叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性，过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外线吸收法[26-27]测定。还原型抗坏血酸(AsA)、氧化型抗坏血酸(DHA)、还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量根据Logan等[28]和Aravind等[29]的方法测定。抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性的测定参考Jiang等[30]的方法。单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)的含量测定参考Nakano等[31]的方法。

1.4 数据处理

采用Excel 2010对试验数据进行整理及绘图，试验数据均为3次重复取平均值±标准误，并用SPSS19.0软件进行LSD多重比较分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 铝胁迫对不同杉木家系幼苗叶片表型和MDA含量的影响

由图1，A可以看出，铝胁迫处理前后两个家系杉木幼苗表型并未发生明显变化，表明浓度1 mmol·L-1短期(10 d)铝胁迫处理对杉木生长表型没有明显的影响。MDA是植物细胞膜脂过氧化的产物，其含量的高低通常用来表征细胞质膜遭受氧化损伤程度的大小。如图1，B所示，铝胁迫显著诱导MDA在两杉木家系幼苗叶片中积累，且铝胁迫下两个杉木家系幼苗叶片MDA含量均显著高于对照(P<0.05)，其中铝敏感型家系YX5和耐铝型家系YX26幼苗叶片中MDA含量分别较对照增加了55.28%和22.82%，说明铝胁迫下耐铝型杉木家系叶片遭受的膜脂过氧化程度明显小于铝敏感型杉木家系YX5。

同一家系不同小写字母表示不同处理间在0.05水平差异显著；下同。图1 铝胁迫下不同耐铝型杉木家系幼苗表型及叶片丙二醛含量的变化Different normal letters of the same family indicate significant differences between different treatments at 0.05 level; The same as belowFig.1 The plant morphology and malondialdehyde content in leaves of C. lanceolata families with contrasting Al tolerance under Al stress

2.2 铝胁迫对不同耐铝型杉木家系幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

图2，A显示，与对照相比，铝胁迫处理显著降低敏感型杉木家系YX5叶片CAT活性(P<0.05)，而对耐铝型杉木家系YX26叶片CAT活性则略有提高，且YX26活性显著高于YX5，表明CAT活性在YX26中的表达属于组成型，而在YX5中的表达属于抑制型。同时，由图2，B可知，与CAT活性变化趋势类似，铝胁迫下敏感型杉木家系YX5叶片SOD活性受到明显抑制，其活性显著低于对照(P<0.05)；尽管铝胁迫下耐铝型杉木家系YX26叶片SOD活性也表现出下降趋势，但其活性与对照组差异并不显著(P>0.05)。另外，与前两个抗氧化酶酶活性变化趋势不同，铝胁迫下两个杉木家系叶片中POD活性(图2，C)均较对照有所增加，其中敏感型杉木家系YX5和耐铝型杉木家系YX26叶片中POD活性分别较对照增加了14.96%和96.27%，且铝处理下耐铝型杉木家系叶片POD活性与对照相比差异达到显著水平(P<0.05)。无论是对照还是铝胁迫处理下，耐铝型杉木家系YX26叶片中CAT和POD活性均高于铝敏感型杉木家系YX5，而耐铝型杉木家系YX26幼苗叶片中SOD活性均不同程度地低于铝敏感型杉木家系YX5。

图2 铝胁迫下不同耐铝型杉木家系幼苗叶片抗氧化酶活性的变化Fig.2 The antioxidant enzyme activities in leaves of C. lanceolata families with contrasting Al tolerance under Al stress

2.3 铝胁迫对不同耐铝型杉木家系幼苗叶片AsA-GSH循环非酶性抗氧化剂含量的影响

铝胁迫条件下，两个杉木家系叶片中AsA的含量均比相应对照显著增加(P<0.05)，其中敏感型杉木家系YX5和耐铝型家系YX26叶片中AsA含量增幅分别达到62.36%和24.18%(图3，A)。与AsA含量表现类似，铝胁迫处理也显著促进GSH在杉木叶片中的积累，其中敏感型家系YX5和耐铝型杉木家系YX26叶片GSH含量分别较对照增加了36.60%和703.93%(图3，B)。与对照相比(图3，C、D)，铝胁迫下两杉木家系叶片中DHA含量不存在显著差异(P>0.05)，但铝胁迫处理大幅显著增加了两个杉木家系叶片中GSSG的含量(P<0.05)，铝敏感家系YX5和耐铝家系YX26叶片中GSSG含量增幅分别为105.38%和135.68%。上述结果表明，铝胁迫下两个杉木家系叶片中非酶性抗氧化剂含量大多显著增加，且耐性家系杉木YX26叶片中GSH、DHA和GSSG的含量增幅明显高于敏感型家系YX5。

2.4 铝胁迫对不同杉木家系幼苗叶片AsA-GSH循环酶活性的影响

铝胁迫处理显著增加了两个杉木家系叶片APX活性(P<0.05)，其中铝敏感型杉木家系YX5和耐铝型杉木家系YX26叶片中APX活性较对照分别增加了16.41%和23.83%(图4，A)。但是，与APX活性变化趋势相反，铝胁迫处理显著抑制两个杉木家系叶片GR活性(P<0.05)(图4，B)。同时，由图4，C可知，铝敏感杉木家系幼苗叶片中MDAR活性在铝胁迫下较对照增加了5.70%(P>0.05)，而耐铝杉木家系YX26叶片中则显著增加了8.66%(P<0.05)。另外，铝胁迫对两个杉木家系幼苗叶片DHAR活性变化具有不同的影响，其中铝敏感杉木家系YX5叶片中DHAR活性较对照显著降低了31.83%，而耐铝杉木家系YX26叶片中则显著增加了26.15%(图4，D)。

图3 铝胁迫下不同耐铝型杉木家系幼苗叶片AsA、GSH、DHA和GSSG含量的变化Fig.3 The contents of AsA, GSH, DHA and GSSG in leaves of C. lanceolata families with contrasting Al tolerance under Al stress

图4 铝胁迫下不同耐铝型家系杉木幼苗叶片AsA-GSH循环酶活性的变化Fig.4 The enzyme activities of AsA-GSH cycle in leaves of C. lanceolata families with contrasting Al tolerance under Al stress

3 讨 论

为减轻逆境胁迫诱导的氧化损伤，维持细胞膜系统结构的稳定性，植物在长期适应逆境胁迫过程中，进化出一套由酶促和非酶促抗氧化系统组成的抗氧化体系，这些抗氧化体系在维持植物体内活性氧稳态平衡，缓解逆境胁迫引起的氧化损伤中发挥着关键作用[36]。SOD、POD和CAT是植物体内重要的抗氧化酶，其通过协同作用清除体内活性氧保护细胞免受氧化损伤。一般而言，逆境胁迫下植物抗氧化酶活性的变化与植物的种类、遭受胁迫的强度以及胁迫时间的长短有关[37]。本试验中铝敏感型杉木家系YX5叶片CAT活性受到显著抑制，尽管耐铝杉木家系YX26在铝胁迫下CAT活性变化并不显著，但无论在正常还是在铝胁迫下其CAT活性均高于敏感型杉木家系YX5，表明铝胁迫下耐性杉木家系YX26组成型维持较高的CAT活性是其较耐受活性氧诱导的氧化损伤的可能原因之一。本试验还表明，铝胁迫下不同耐铝型家系杉木幼苗叶片SOD活性均出现下降，而且敏感型杉木家系YX5幼苗叶片中SOD活性下降幅度大于耐铝型杉木家系YX26，这可能由于敏感型杉木家系自身对铝胁迫的抵抗能力有限，高浓度和长时间的铝处理使其酶活性显著降低。陈志刚等[38]研究也发现随着铝处理浓度的增加(当铝浓度超过100 mg·L-1时)和处理时间的延长(>8 h)，黑麦草(Lolium)根系SOD活性显著降低。另外，本试验中铝胁迫下不同杉木家系叶片POD活性均表现出增加的趋势，且耐铝型杉木家系YX26叶片POD活性显著高于对照，表明铝胁迫下耐性杉木家系增强了自身活性氧清除能力，这与铝胁迫下不同耐铝型栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim.)[39]和玉米[40]的POD活性变化规律一致。由此可见，与铝敏感型杉木家系相比，铝胁迫下耐铝型杉木家系具有较高的保护酶活性，从而使其具有更强的活性氧清除能力，这可能是导致耐铝型杉木家系YX26比敏感型杉木家系YX5更耐铝胁迫诱导的氧化损伤的原因之一，同时也表明抗氧化酶在杉木耐铝性调控中扮演着关键角色。

除了常规的抗氧化酶SOD、POD和CAT外，AsA-GSH循环关键酶如APX、GR、DHAR和MDAR也是植物体内活性氧清除的另一关键途径[21-24]。在AsA-GSH循环中，APX主要利用AsA来清除H2O2，其对H2O2的亲和性要远大于CAT；GR则主要催化GSSG还原为GSH，而GSH通过为H2O2提供电子供体将H2O2还原成水，同时GSH被氧化成GSSG；MDHA和MDHAR则主要介导AsA再生[41]。大量研究表明铝在引起植物氧化损伤的同时，也能够刺激植物AsA-GSH循环中相关酶活性的提高，增强植物对活性氧的清除能力[17,42-43]。本试验同样发现铝胁迫下两个杉木家系叶片APX活性均较对照显著增加，表明铝胁迫下杉木通过提高自身对H2O2清除的能力，从而减轻铝胁迫诱导的氧化损伤。而且耐铝型杉木家系YX26叶片APX活性增幅要高于敏感型杉木家系YX5，暗示铝胁迫下耐铝型杉木家系YX26叶片受到的氧化损伤小于铝敏感型YX5，可能与其维持较高的APX活性，从而具有增强活性氧清除能力有关。与本研究结果类似，前期一些研究也表明铝胁迫能显著增加植物体内APX活性[17,43-44]，可见铝胁迫下APX活性的提高是植物应答铝胁迫的通用机制。GR是AsA-GSH循环另一关键酶，本试验中铝胁迫下不同耐铝型杉木家系幼苗叶片GR活性均显著受到抑制，这可能由于GR对铝胁迫较为敏感，高浓度或长时间的铝处理使其活性显著受抑，这与李琲琲等[24]和马进等[22]研究发现高浓度(500 mmol·L-1NaCl)和长时间(8 d)盐胁迫处理显著降低大麦(HordeumvulgareL.)和紫花苜蓿(MedicagosativaL.)GR活性的结论相似。MDAR和DHAR是AsA再生关键酶[45]。本试验中发现，铝胁迫处理显著提高耐铝型杉木家系YX26叶片MDAR和DHAR活性，而敏感型杉木家系YX5叶片MDAR略有增加，但DHAR活性却显著受抑。铝胁迫下耐铝型杉木家系YX26通过显著增加MDAR和DHAR活性，促进AsA的循环再生，一方面有利于维持植物细胞内较高的还原态微环境，避免细胞内环境呈现氧化态而带来的一系列问题。另一方面，增加AsA和GSH的积累，还能有效清除铝胁迫诱导的活性氧，这也在一定程度上说明了铝胁迫下耐铝型杉木YX26受到的氧化损伤程度低于铝敏感型杉木家系YX5的原因，该结果同时也表明AsA-GSH循环关键酶同样在调控杉木耐铝性中起着重要作用。

AsA和GSH作为非酶性抗氧化物质，同样在清除植物体内活性氧方面具有重要作用，它们通常与AsA-GSH循环关键酶相互偶联起作用[46]。与前人研究结果类似，本研究中也发现铝胁迫显著增加了不同耐铝型杉木家系叶片中AsA和GSH含量，这可能是杉木应对铝毒的一种适应性反应，通过促进二者的积累来增强自身的耐性。尽管铝胁迫均显著增加了AsA和GSH的含量，但敏感型杉木家系YX5叶片中AsA含量高于耐铝型杉木YX26，这可能与其细胞内大量的AsA用于解毒有关。此外，铝胁迫下耐铝型杉木家系YX26中APX活性增幅大于YX5也从侧面证实铝胁迫下YX26中AsA维持较高的周转速率，从而减轻过氧化氢对YX26叶片造成的氧化损伤。铝胁迫下耐铝型杉木家系YX26叶片中GSH含量的增幅要显著大于敏感型杉木家系YX5，GSH含量的增加一方面有利于为AsA-GSH循环提供充足底物，维持AsA-GSH循环高效运转，另一方面能使植物具有更强的活性氧清除能力，有效减轻铝胁迫诱导的氧化损伤。因此，这可能也是铝胁迫下耐铝型杉木家系YX26受到的氧化损伤要低于铝敏感型杉木家系YX5的可能原因。

综上所述，与铝敏感型杉木家系YX5相比，铝胁迫下耐铝型杉木家系YX26通过维持较高的CAT和POD活性，同时通过增加铝胁迫下APX、DHAR和MDAR的活性，提高AsA-GSH循环的运行效率，促进AsA和GSH的再生，进而增强其自身对活性氧的清除能力，从而最终减轻铝胁迫对杉木叶片造成的氧化损伤，使植株表现出更强的耐铝能力。