供磷水平对刺梨幼苗生长和养分含量及其相关生理指标的影响

官纪元，樊卫国*

(1 贵州大学 农学院，贵阳550025；2 贵州省果树工程技术研究中心，贵阳550025)

刺梨(RosaroxburghiiTratt.)是原产中国西南地区的特色果树，目前在贵州喀斯特地区石灰性土壤上的种植规模日益扩大。石灰性土壤中有效磷含量极低[1-2]，因此，刺梨面临严重的磷养分胁迫问题。研究不同供磷水平对刺梨苗生长和养分含量及相关生理指标的影响，对于了解刺梨适应低磷胁迫的机制和栽培中磷养分的调控都具有重要的科学意义。

植物对磷的需求和对低磷胁迫的适应机制存在差异，合理的施磷量可以促进植物生长，供磷过多或过少对生长都会产生抑制[3-7]。对低磷胁迫适应能力强的植物，能够通过根系的总面积、平均直径、侧根及根毛数量和长度的增加或排根的形成增大根系与土壤的接触面积，从而增强对土壤中磷的截获[6-11]。在生理上，能够通过体内酸性磷酸酶(APase)和根系分泌性酸性磷酸酶(SAPase)活性的增强、根系小分子有机酸和SAPase分泌量的增加适应低磷胁迫，APase活性的增强能够促进植物体内有机磷转化为无机磷供植物循环利用[12-14]，分泌到根际中的小分子有机酸和SAPase能够促进根际土壤中难溶性磷的活化，提高磷的有效性，进而促进植物对磷的吸收[15]。不同植物根系分泌的小分子有机酸种类、含量及功能具有差异性[15-18]，然而在根中有机酸的合成是其向根外分泌的重要物质基础。磷对植物吸收其他营养元素有重要的影响，在烟草(Nicotianatabacum)[19]、大豆(Glycinemax)[20]、豇豆(Vignaunguiculata)[21]、巴西橡胶(Heveabrasiliensis)[22]等植物上的研究发现，当适当提高供磷水平后，这些植物对氮素的吸收量增加，这一相助作用与磷能够促进根系中硝酸还原酶(NR)活性增强密切相关[23]。过低或过高的供磷水平都会导致植物体内养分失衡，施磷过量会抑制植物对铁、锌及铜等元素的吸收[2]，在低磷胁迫下柑橘(Citrusreticulata)叶片中氮、磷、钾、钙、镁、锰、硼等元素的含量明显减少[4]。

迄今，仅发现刺梨对缺磷胁迫的反应十分敏感[24]，有关低磷胁迫对刺梨生长、根系形态、养分吸收及相关生理特性的影响尚不了解，刺梨适应低磷胁迫的机制更不清楚。为此，本试验采用石英砂和蛭石混合基质培养的方法，研究了不同供磷水平对‘贵农5号’刺梨实生苗的生长、根系形态特征、根和叶中APase、NR以及根中SAPase的活性、根中小分子有机酸组分及含量和植株中营养元素含量的影响，旨在为揭示刺梨适应低磷胁迫的机制和喀斯特地区刺梨栽培的磷养分管理提供科学的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于2016年和2017年在贵州省果树工程技术研究中心进行。试材为‘贵农5号’刺梨实生苗。用于试材幼苗培育的种子从‘贵农5号’刺梨品种的1个单株上采集，采种单株在开花期用透气透光无纺布棚罩进行异花授粉隔离，以获得自花授粉的种子，尽量降低试材幼苗个体间遗传差异的影响。培养基质由2∶1的蛭石和石英砂混合而成，事先用0.3 %的HCl溶液浸泡7 d后反复用蒸馏水冲洗后备用。培养容器为口径30 cm、高45 cm的塑料桶。营养液配制所用化合物为分析纯，水用去离子水。测定根中有机酸组分及含量的所用的标准品为色谱纯，购自Sigma公司。

1.2 材料的培养与处理

试验设7个不同供磷水平处理，各处理营养液中有效磷(P2O5)含量分别为5、25、45、65、85、105及125 mg·L-1。每个处理3桶，重复4次，每桶植苗10株。每年3月10日将层积处理后的‘贵农5号’刺梨种子在蛭石基质苗床上播种育苗，待幼苗长到2叶1心时移栽在培养基质中，然后浇去离子水适应1周，再浇1/2浓度的不同处理营养液适应1周后进行不同供磷水平处理培养。试验培养的营养液选用Hongland和Arnon配方[25]作为基本配方，根据刺梨偏好硝态氮的营养特性[26]，将营养液中的氮用NO3--N和NH4+-N提供，硝铵比为3∶1。营养液中除磷的浓度不同外，其他营养元素的浓度均与Hongland及Arnon营养液配方一致。用0.1 mol·L-1的NaOH和H2SO4将营养液pH值调整到6.0。营养液中加入7 μmol·L-1硝化抑制剂二氢胺，以防止NH4+的硝化后改变营养液中NO3--N和NH4+-N的比例。培养处理期间每隔7 d浇营养液1次，每次浇营养液前用pH6.0的去离子水对培养基质进行冗余灌浇，避免磷在基质中富集改变其浓度，然后再用不同处理的营养液进行冗余浇灌，让多余的营养液从培养容器底部排水孔溢出，避免基质中营养液浓度被稀释。材料培养至第60天时取样测定以下各项指标。

1.3 取样和指标测定

1.3.1生长和根系形态指标在分别测定不同处理下植株株高和基径后，然后小心翻盆取出刺梨苗，每个处理取12株(4次重复，每个重复3株)测定整株及地上部、根系的鲜质量，将植株用去离子水洗净后，在105 ℃下杀酶10 min，置于55 ℃下烘干至恒重，测定整株、地上部及根系的干质量，并计算根冠比。另外，在每个处理的4次重复中各取1株用Epson Perfection 4990 Photo根系扫描仪和图像分析软件WinRHIZO (Express 1000XL1.0版)对根系总长度、平均直径、总表面积、总体积及总根尖数进行测定和分析。

将不同处理的培养基质用水轻轻的淋洗，小心取出完整无损伤的根系，从上取不同处理的根冠之后0～3 cm根毛区的生长根，在Olympus BX-63数字显微镜下观察、测定和记录根毛的长度及单位长度上的数量，计算根毛的平均长度和根毛密度，根毛密度以1 cm长度的生长根根段上的根毛数表示。

1.3.2酸性磷酸酶和硝酸还原酶活性取每个处理的植株中部叶片和生长根各0.2 g，采用Bacber法[27]测定叶片和根中的APase活性；采用Mclanchlan法[28]测定根系的SAPase活性；采用离体法[29]测定叶片和根中NR的活性。每个处理的同一生理指标取样4份进行4次重复测定。

1.3.3根系中有机酸种类和含量称取不同处理的生长根各4份，每份1.5 g，剪碎置于研钵中，加入3 mL蒸馏水和少许石英砂将根系研磨成匀浆，移入10 mL离心管，再用1 mL蒸馏水洗涤研钵2次并转移至离心管，滴入3滴百里酚以抑制微生物活动，液体总体积为5 mL。于45 ℃水浴中提取15 min，转速20 000 r·min-1离心20 min，上清液过0.45 μm滤膜后再用HPLC进行4次重复测定。

色谱条件: Wondasil C18型色谱柱，柱温30 ℃，流动相A为0.022 mol·L-1KH2PO4溶液(pH 2.2)，流动相B为甲醇(色谱纯)，进样量为20 μL，紫外检测波长为210 nm，上机测定的洗脱模式为等浓度洗脱，总流速0.7 mL·min-1，流动相B浓度3.0%。

有机酸标样的标准曲线绘制：先配制10 mg·mL-1的草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸标准储备液和1 mg·mL-1的乙酸标准储备液，分别按照草酸与酒石酸1∶5的体积比以及草酸与其他4种有机酸1∶10的体积比吸取各有机酸标准储备液，根据实验需要配制出不同浓度的混合标准液。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘标准曲线。

1.3.4整株矿质元素含量将烘干的刺梨苗整株研磨粉碎，过筛，每个处理都分别准确称取4份样品各0.5 g，用于测定N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn及B的含量，每个元素均进行4次重复测定。N含量测定用凯氏定氮法，P含量测定用钒钼黄比色法，K含量测定用火焰光度计法，Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn含量测定用原子吸收分光光度计法，B含量测定用姜黄素比色法[30]。

1.4 数据统计与分析

利用DPS V7.05统计软件进行显著性和相关性分析，多重比较采用Duncan’s新复极差法。文中数据均为2年2次试验结果的平均值。

2 结果与分析

2.1 不同磷水平对刺梨苗生长及根系形态特征的影响

研究结果表明，适宜的供磷水平可以促进刺梨苗的生长，过低或过高的供磷水平都会对刺梨苗的生长产生抑制。图1和表1显示，刺梨苗在不同磷水平处理间的生长差异明显。其中，在45 mg·L-1供磷水平下，刺梨苗的长势最好，株高、基径和生物量都最大；随供磷水平的增加或降低，刺梨苗的生长受到明显抑制，植株的高度、基径和生物量随之减小；在高于65 mg·L-1磷水平的3个处理中，植株的生长指标比5 mg·L-1低磷水平处理的还要小，说明供磷水平过高对刺梨苗生长的抑制比低磷胁迫更加严重。同时，表1还显示，刺梨苗根冠比在5 mg·L-1供磷水平下最大，当增大供磷水平后表现出明显减小的趋势。

从表2可看出，在45 mg·L-1的供磷水平下，刺梨苗根的总长度、总表面积、总体积、平均直径和总根尖数都最大，并与其他供磷水平处理的差异都达到显著水平(P<0.05)，降低或提高供磷水平后上述指标都显著下降。然而, 根毛长度及密度的变化在不同供磷水平的处理中却有所不同，其中，根毛的长度和密度在5 mg·L-1低磷水平下达到最大，随供磷水平的提高根毛的长度和密度明显下降。5 mg·L-1低磷水平的根毛长度和密度分别是125 mg·L-1高磷水平的4倍以上和7倍以上。可见，低磷水平下根毛长度和密度的增大可能是刺梨苗应对低磷胁迫所采取的适应策略，这对于刺梨增强磷的吸收和缓解低磷胁迫对自身的不利影响具有重要作用。17:01 2018/9/5

图1 不同磷水平下刺梨苗生长状态Fig.1 Growth status of Rosa roxburghii seedlings under different supply levels of phosphorus

供磷水平Levels of P/(mg·L-1)株高Plant height/cm基径Base diameter/cm生物量Biomass/(g·plant-1)地上部Shoot根系Root整株Plant根冠比值Root-shoot ratio514.47±0.55e0.24±0.02d0.26±0.01e0.23±0.01e0.49±0.02e0.88±0.02a2522.50±0.50c0.35±0.01c0.70±0.04c0.43±0.01c1.13±0.04c0.61±0.04c4533.70±0.36a0.46±0.01a2.44±0.06a0.99±0.04a3.43±0.09a0.41±0.30g6525.13±0.80b0.39±0.01b1.20±0.06b0.56±0.03b1.76±0.07b0.47±0.01f8515.67±0.42d0.22±0.02d0.50±0.02d0.26±0.02d0.76±0.03d0.52±0.02e10510.13±0.61f0.20±0.01e0.31±0.01e0.18±0.01f0.48±0.02e0.58±0.02d1257.33±0.42g0.17±0.01f0.19±0.01f0.12±0.01g0.31±0.01f0.63±0.02b

注：在同一列中不同的小写字母表示0.05水平显著差异。下同

Note: Different normal letters in same column mean significant difference at 0.05 level. The same as below.

表2 不同磷水平下刺梨苗根系形态特征的变化

表3 不同磷水平下刺梨苗叶片和根中的APase、NR和SAPase的活性

2.2 不同磷水平对刺梨苗叶片、根系中APase及NR和SAPase活性的影响

表3显示，在5 mg·L-1供磷水平下，刺梨苗叶片和根中的APase及根中SAPase的活性达到最强，显著高于其他供磷水平；随供磷水平的进一步提高，叶片及根中的APase和根中SAPase的活性明显减弱，且处理间的差异都达到显著水平(P<0.05)，说明低磷胁迫会诱导刺梨苗叶片及根中APase和根中SAPase的活性增强，这也是刺梨应对低磷胁迫所采取的重要生理适应策略。同时，刺梨苗叶片和根中的NR活性以45 mg·L-1供磷水平的处理为最强，降低或提高供磷水平后NR的活性均明显减弱(表3)。因此，供磷水平过低或过高都可能会对刺梨氮的吸收与同化产生不利的影响。

2.3 不同磷水平对刺梨苗根中小分子有机酸种类及含量的影响

本试验结果表明，从不同磷水平处理的刺梨苗根中检测到草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、乙酸和琥珀酸等6种小分子有机酸(表4)。其中，在5 mg·L-1磷水平处理的刺梨苗根中，上述6种小分子有机酸的含量均达到最高，而随供磷水平的提高，根中6种小分子有机酸及其总含量随之降低，说明低磷胁迫具有诱导刺梨苗根中小分子有机酸合成的作用，这一生理响应与刺梨苗遭受低磷胁迫后根系对外分泌有机酸可能具有重要的联系。

2.4 不同磷水平对刺梨苗中营养元素含量的影响

在不同磷水平下刺梨苗中各种营养元素的含量具有明显的差异性。表5显示，对于刺梨苗中N、K、Fe、Mn、Cu、B元素，其含量以45 mg·L-1磷水平处理的为最高，降低或提高供磷水平后上述元素都明显减少；当供磷水平提高到85 mg·L-1以上后，上述元素含量的减少更加明显。同时，刺梨苗中P、Ca和Mg的含量随供磷水平的增大而增加，Zn的含量则随供磷水平的增大而降低。另外，刺梨苗中K和Fe的含量在45和65 mg·L-1两个磷水平处理间的差异不显著，刺梨苗中B的含量在25和45 mg·L-1供磷水平处理之间也没有显著差异，其他供磷水平处理间刺梨苗中N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn及B的含量差异均达到显著水平(P<0.05)。以上结果说明：供磷过多对刺梨吸收N、K、Fe、Mn、Cu、B、Zn元素有更加不利的影响，但对其吸收P、Ca和Mg元素有明显促进作用。

3 讨 论

植物应对低磷胁迫会表现出根系形态变化、磷酸酶活性增强和根系分泌物增加等适应机制，在不同植物上以上适应机制具有差异性[15]。根冠比增大是植物应对低磷胁迫的反应之一，在低磷胁迫下植物通过根系的增大以增强对磷的吸收，通过地上部生长的减弱以降低对磷的消耗，这种适应性反应还与较多的磷向根系分配有关[31]。在低磷水平下，刺梨苗根冠比明显增大，类似的结果在很多植物上都有报道[4,9,32-33]。植物还能够通过根系形态的变化适应低磷胁迫，通常表现出根的表面积、侧根和根毛的长度及数量的增加，以此增加根系与土壤的接触面积，增强对磷的截获能力[11]。根毛对养分吸收有重要的作用，它可使根的表面积增加1～10倍以上[34]。在本研究中，在5 mg·L-1的低磷水平下刺梨苗根的总长度、总表面积、总体积和总根尖数虽然没有增加，但根毛长度和密度的却成倍的增加了，这对增强根系对养分的吸收具有极其重要的促进作用，这也是刺梨苗应对低磷胁迫采取的重要适应策略。

同时，在不同供磷水平条件下，刺梨苗根和叶中的Apase和根中的SAPase活性变化是协同一致的，均表现为随供磷水平的降低而增强，低磷胁迫下Apase和SAPase的活性达到最强，这是因为APase是一个诱导酶，植物获得低磷胁迫信号后会诱导体内Apase基因的表达，促进Apase的合成并且增强其活性，从而促进体内有机磷转化为无机磷供生长循环利用[35-37]。因此，低磷胁迫下刺梨根和叶中Apase活性的增强对缓解自身因供磷不足造成的不利影响有积极的作用。在低磷条件下刺梨苗根中SAPase的活性增强，意味着刺梨根系会增大磷酸酶的分泌量，从而会促进根际环境中有机磷的分解，改善有效磷的供给。低磷胁迫下刺梨苗叶片及根中APase和根中SAPase的活性增强，实际上是刺梨苗应对低磷胁迫采取的重要生理适应策略。

植物的根和叶分别是NO3-还原的主要场所[32]。低磷胁迫会降低刺梨苗根、叶中的NR活性，因此对氮的吸收与代谢具有不利的影响。NR是限速酶，植物吸收的NO3-进入细胞后，可以诱导NR的产生，增强其活性[38]，从而促进NO3-还原成NH3及以后的氮同化过程[39]。磷是NADPH的组成元素, NADP+/NADPH作为NR的电子载体, 可将电子从FAD转移到NO3-上, 使其还原为NO2-，最终还原成NH3[40]，因此，可以肯定缺磷对刺梨苗氮的吸收与同化有抑制作用，这一作用与低磷胁迫引起刺梨苗体内缺磷导致NR活性减弱有关。以往的研究已证实，刺梨具有偏好吸收NO3--N的特性[41]，供磷水平过低、过高都会降低刺梨对NO3--N的吸收[42]。本试验供氮的硝铵比为3∶1，在45 mg·L-1磷水平下刺梨苗中氮含量最高，意味着NO3-的吸收量也会相应的增大，从而会诱导刺梨叶和根中NR活性的增强。供磷过低或过高后，刺梨苗中NR的活性会随NO3-的吸收量减少而减弱。

在缺磷环境中，植物的根系会增加小分子有机酸分泌量，从而通过有机酸的酸溶、螯溶和解吸附作用提高土壤中磷的有效含量[43-46]，在本研究中，低磷胁迫下刺梨根中6种小分子有机酸的含量都明显提高了，说明低磷胁迫能够诱导刺梨根中小分子有机酸的合成，这一结果会增加刺梨根系向根外分泌小分子有机酸的物质基础，这也是刺梨适应低磷胁迫的重要生理表征。

果树在吸收P的过程中对其他营养元素的吸收具有相助或拮抗的作用，其中P与Zn是具有拮抗作用，施P和吸收P过多会降低Zn的吸收[47]。在柑橘[4]和铁核桃(Juglanssigillata)[9]上，低磷胁迫或供磷过多会使N、K、Fe、Zn、B等营养元素的含量或吸收量降低。在本研究中，在供磷水平达到45 mg·L-1时，刺梨苗的生物量最大，N、K、Fe、Mn、Cu、B的含量最高，说明适宜的供磷水平有利于刺梨苗的生长和对上述营养元素的吸收，降低或增加供磷水平对上述营养元素的吸收会产生不利的影响，类似的结果在油茶(Camelliaoleifera)[48]、扁桃(Amygdaluscommunis)[49]、梨栆(Zizyphusjujuba)[50]等树种上都有报道。刺梨苗中Ca和Mg的含量随着供磷水平的提高而增大，这可能与P与Ca、Mg元素之间吸收的相助作用有关[2,51]，这在柑橘[4]、铁核桃[9]等树种上也有类似报道。

综上所述，供磷水平过高或过低均会降低刺梨苗的生物量、根的总长度、总表面积、总体积、平均直径和总根尖数，这是刺梨苗的生长受到抑制的结果。刺梨苗具有应对低磷胁迫的适应策略，在低磷条件下刺梨苗的根冠比值、根毛长度和密度的增大，根和叶片中的APase及根中SAPase的活性明显增强，根中的小分子有机酸含量的明显增加，是其适应策略的重要表征。适宜供磷水平有利于刺梨苗对各种营养元素的吸收，在45 mg·L-1供磷条件下，刺梨苗中的N、P、K、Mn、Cu、B含量明显提高，进一步降低或提高供磷水平后对刺梨苗中上述元素的含量有降低作用。低磷胁迫下导致刺梨苗中N含量降低与缺磷引起NR的活性减弱有关。刺梨苗中P、Ca和Mg的含量随供磷水平的提高而增大，Zn的含量随供磷水平的增大而减小。今后应深入研究低磷胁迫诱导刺梨根毛发生变化的机理和Apase活性增强的分子机制，揭示刺梨根系中小分子有机酸的合成与分泌对适应低磷胁迫的作用，同时要通过栽培试验进一步探究土壤中有效磷含量多少对刺梨生长和果实产品及品质的影响，为深入解析刺梨适应低磷胁迫的机理和生产上的磷养分管理提供科学依据。