肺腺癌Ubiquilin 1蛋白的表达与临床病理关系的研究

孟文 王闻哲 孟靖飞 冯兴 江洪 王宇 王效举

肺癌是严重影响人群生命健康的恶性肿瘤之一[1]，肺腺癌是肺癌主要的病理类型。尽管针对肺癌的治疗已有长足的进步，但目前其5年生存率仍然较差[2]。发现有效的肺癌标志物，从而筛选出肺癌手术后的高危患者，及时采取有效的治疗措施，对延长手术后患者生存期有重要意义。Ubiquilin 1蛋白是泛素样蛋白，可以介导错误折叠蛋白的降解，参与一些病理生理过程[3]。本研究探讨肺腺癌中Ubiquilin 1蛋白的表达与临床病理特征的关系，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 由国家人类遗传资源共享服务平台提供并制作的肺腺癌组织芯片，为2004年7月至2009年6月90例肺腺癌手术切除的标本，男49例，女41例，年龄30～84（62.4±9.9）岁。其中根治性手术 79 例，非根治性手术8例，手术方式不详3例。平台编号：2005DKA21300；实验编号：13939；阵列编号：HLug-Ade180Sur-01；分析点数：180，包括90例患者肺腺癌组织点和配对癌旁正

常组织点。组织芯片样点包括肺腺癌癌区域及配对正常癌旁组织（距肿瘤＞3.0cm），均经病理检查证实。病理分期根据肺癌第七版TNM分期。生存时间从手术结束时间开始计算，随访时间5～10年。另选择杭州市第一人民医院2012年1月至2014年6月因肺结节住院手术的患者17例作为对照，手术后诊断均为肺良性病变，包括肺错构瘤7例，肺肉芽肿性变4例，硬化性血管瘤2例，炎性假瘤4例。本研究经杭州市第一人民医院伦理学委员会同意，所有患者均知情同意并填写知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色及分析 所用抗体Anti-Ubiquilin1购于杭州麦通生物技术有限公司（Abcam公司，目录号：ab128011）。应用免疫组化Envision二步法完成免疫组化实验，抗体的稀释度：1∶1 500。两位病理医师独自做出判断,对于有异议或疑难病例，由上级医师会诊，做出最终诊断。定位判定：细胞质、细胞膜、细胞核。染色强度的判定：在低倍镜下对整个视野进行观察，将染色强度分为4级：0分：细胞无染色；1分：轻度染色，淡黄色；2分：中度染色，棕黄色；3分：强染色，棕褐色。选取3个不同的染色强度视野，在高倍镜下分别估算其阳性率，取其平均值，将染色比例分为5级：0分：阳性细胞数＜5%；1分：5%～25%的阳性细胞；2分：26%～50%的阳性细胞；3分：51%～75%的阳性细胞；4分：≥76%的阳性细胞。表达水平=染色强度分数+染色比例分数。表达水平0～3为低表达，4～7为高表达。

1.2.2 观察指标 （1）应用免疫组化的方法对组织芯片进行Ubiquilin1蛋白染色，判断癌组织及癌旁组织之间的表达差异。（2）分析肺腺癌Ubiquilin1蛋白的高表达与性别、年龄、肿瘤大小、癌的分化分级、淋巴结转移、TNM分期、癌旁Ubiquilin1蛋白高表达、5年生存率、表皮生长因子受体（EGFR）状态的关系。（3）分析癌旁U-biquilin1蛋白的高表达、癌的高表达、性别、年龄、肿瘤大小、癌的分化分级、淋巴结转移、TNM分期、肿瘤的位置与生存的关系。（4）分析癌及癌旁Ubiquilin1蛋白表达与生存的关系。（5）对17例肺良性疾患的组织切片进行Ubiquilin1蛋白染色，分析其表达，并与肺腺癌及癌旁表达比较。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。肺腺癌及配对癌旁之间的Ubiquilin 1蛋白的表达差异应用paired Wilcoxon检验。Ubiquilin 1蛋白的表达与临床病理的关系采用χ2检验。多因素Cox回归模型分析对预后有意义的因素，采用Kaplan-Meier的方法绘制生存曲线，并采用Log-nank统计检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌和癌旁中Ubiquilin 1蛋白表达的比较 在芯片制作过程中发生脱片2例，故在随后的研究中删除此2例，共计88例。典型病例结果见图1-3（插页）。

由图1-3可见，典型病例1患者肺腺癌及癌旁均可见Ubiquilin 1蛋白高表达。典型病例2患者肺腺癌高表达，癌旁低表达。典型病例3肺腺癌及癌旁均可见低表达。阳性染色位于细胞质，细胞膜及细胞核无染色。88例腺癌组织中,高表达60例（68.2%），而配对癌旁高表达仅为26例（29.5%）。两者比较，差异有统计学意义（Z=-5.831，P＜0.01）。17例肺良性病变患者中，高表达3例（17.6%），其中肺错构瘤2例，炎性肉芽肿阳性1例，高表达率与肺腺癌高表达率比较，差异有统计学意义（χ2=15.160，P＜0.01），与癌旁高表达率比较，差异无统计学意义（χ2=0.502，P=0.479）。

2.2 肺腺癌Ubiquilin 1蛋白表达与临床病理特征关系随访过程中，EGFR表达信息不全7例，淋巴结转移信息不全3例，病理分期结果缺失4例，肺腺癌组织中U-biquilin 1蛋白表达与临床病理特征关系见表1。

由表1可见，肺腺癌高表达与配对癌旁高表达及5年生存率相关（P＜0.01）。但与性别、年龄、肿瘤大小、癌的分化分级、淋巴结转移、TNM分期、EGFR表达均无关（均P＞0.05）。

2.3 肺腺癌的生存分析 见表2、图4。

由表2可见，肺癌中高表达、癌旁中高表达、TNM分期、性别、癌的分化分级是回归模型筛选出来的预后因子，其中，肺癌中高表达、癌旁中高表达、TNM分期、性别是统计学有意义的预后指标（P＜0.05）。

由图4可见，肺癌高表达及癌旁高表达均与不良预后有关（P＜0.000）。

3 讨论

Ubiquilin1蛋白与肺腺癌的关系目前还未定论。目前对该蛋白结构的研究发现，其包含了泛素样（UBL）区域、泛素相关（UBA）区域、多个热休克伴侣（STI）区域，Ubiquilin 1蛋白通过UBA区域与泛素化蛋白相互作用，通过UBL区域与蛋白酶体相互作用[4-6]。因此，其可以在泛素化蛋白和蛋白酶体之间充当“桥梁”作用，促进泛素化蛋白的降解，通过这种机制参与多种病理或生理过程。Beverly等[3]研究显示，Ubiquilin1蛋白能与抗凋亡基因BCL2编码的BCLb相互作用，促进BCLb多个位点的泛素化，这对保持BCLb的稳定性有重要意义，所以其在抗凋亡过程中起重要作用。Funakoshi等[7]报道，非洲爪蟾Ubiquilin 1同源基因XDRP1，与cyclinA（A1和A2）结合，有阻止爪蟾胚胎细胞进一步分化的作用。Ubiquilin 1还可与肿瘤抑制蛋白DAN和S蛋白相互作用，调整DNA合成，进而影响细胞分化。Ubiquilin 1与肿瘤作用机制研究愈来愈引起人们的兴趣，但详细的作用机制仍需进一步深入研究。

表1 肺腺癌Ubiquilin 1蛋白的高表达与临床特征病理关系

少数研究发现，肺腺癌Ubiquilin 1 mRNA水平较正常对照显著增高[3，8]。Chen 等[8]应用 Western blot的方法，对9例肺腺癌和配对癌旁组织的比较发现：Ubiquilin 1蛋白水平在肺腺癌中高于癌旁正常对照，血清Ubiquilin 1自身抗体对肺腺癌的诊断起重要作用[8-11]。所以，先前的研究提示Ubiquilin 1很可能参与了肺腺癌的发生、发展过程，Ubiquilin 1蛋白可能与肺腺癌的临床病理存在着某种重要的联系。

表2 肺腺癌预后变量分析

图4 Kaplan-Meier曲线分析Ubiquilin1蛋白表达与预后的关系（a:肺腺癌组织中Ubiquilin1蛋白高表达与低表达的比较；b:肺腺癌癌旁组织Ubiquilin1蛋白高表达与低表达的比较）

本研究发现：肺腺癌组织中Ubiquilin 1蛋白的表达主要位于细胞质，并且高于配对的癌旁正常组织，差异有统计学意义，Ubiquilin 1在肺腺癌的发生、发展过程中充当重要的角色，而其具体的作用位置可能就在细胞质。关于Ubiquilin 1与预后的研究，Beverly在其基因水平，对少数肺腺癌患者进行了初步的研究，Beverly等[3]研究了19例低表达的肺癌患者以及19例高表达肺癌患者发现高表达患者的预后较差。该项研究通过组织芯片技术（TMA）对88例肺腺癌与长期预后的关系（5～10年）研究，发现Ubiquilin 1在蛋白水平亦与长期不良预后相关。Ubiquilin 1蛋白高表达与性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移状态、EGFR表达状态无关。该研究还发现，肺癌高表达Ubiquilin 1、肿瘤分期是肺腺癌生存模型中有统计学意义的因素。因此，Ubiquilin 1可以作为肺腺癌手术后潜在的重要预测因子，对于筛选手术后高危患者可能有重要的补充意义。

本研究发现，Ubiquilin 1蛋白在癌旁中的高表达与肺腺癌不良预后有关，提示Ubiquilin 1在肺腺癌癌旁微环境中可能扮演重要角色。癌旁组织中的高U-biquilin 1对于肺腺癌的生长及进展起促进作用。另外一项研究提示Ubiquilin 1在肿瘤发生过程中起调节作用，具有抑制迁移及非小细胞肺癌细胞的上皮间质转化的作用[12]。所以，Ubiquilin 1在肺腺癌发生、发展中所充当的角色可能相当复杂，仍需进一步研究。

综上所述，本研究较为系统地研究了Ubiquilin 1与肺腺癌临床病理、预后的关系，随访时间较长，达到5～10年。研究证明肺腺癌及癌旁正常高表达U-biquilin 1蛋白与不良预后有关，其可以作为潜在的评价预后指标，指导肺腺癌的手术后治疗。Ubiquilin 1与肺腺癌之间的具体作用机制，仍需进一步研究。

图1 典型病例1的HE染色结果及免疫组化染色结果（a:腺癌组织，HE染色，×35；b：癌旁组织，HE染色，×35；c：腺癌组织，免疫组化染色，×35；d：癌旁组织，免疫组化染色，×35）

图2 典型病例2的HE染色结果及免疫组化染色结果（a:腺癌组织，HE染色，×35；b：癌旁组织，HE染色，×35；c：腺癌组织，免疫组化染色，×35；d：癌旁组织，免疫组化染色，×35）

图3 典型病例3的HE染色结果及免疫组化染色结果（a:腺癌组织，HE染色，×35；b：癌旁组织，HE染色，×35；c：腺癌组织，免疫组化染色，×35；d：癌旁组织，免疫组化染色，×35）