miR-30b在肺癌细胞HCC-827侵袭中的作用及相关通路研究

徐峰 张波 张健 齐泽铖 徐建峰 朱成楚

肺癌是世界范围内第一大癌症疾病，其中约80%为非小细胞肺癌（NSCLC）[1]。近些年，肺癌无论在发生率还是病死率均逐年增长，与吸烟、空气环境恶化有密切关系。尽管肺癌的检测手段和手术方式不断改进，但患者的5年生存率依旧低下，仅为15%[2]，在一些发展中国家，5年生存率更低。表皮生长因子受体（EGFR）广泛分布于细胞表面，对细胞的生长、增殖、分化起到关键作用，同时与肿瘤的生长、侵袭和转移有关。microRNA是一群由20～24个核苷酸构成的不具有编码功能的微小RNA,它们在肿瘤细胞增殖、分化与凋亡的过程中起着

重要作用[3-5]，miR-30b在多种肿瘤中表达异常，但其在NSCLC进程中的机制尚不清楚。本研究分析miR-30b在肺癌细胞HCC-827侵袭中的作用及对相关通路的影响，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 肺癌细胞HCC-827购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。DMEM培养基、opti-MEM培养基购自赛默飞公司。胰蛋白酶、青霉素-链霉素双抗购自上海生工公司。二甲基亚砜（DMSO）；lipofectamine 2000脂质体购自美国invitrogen公司。无核酸酶水（DEPC处理水）购自北京索莱宝生物科技有限公司。TRIzol裂解液购自美国SIGMA公司。山羊抗兔抗体购自上海碧云天生物技术研究所。上样缓冲液（loading buffer）购自上海捷瑞生物工程有限公司。microRNA检测试剂盒购自上海吉玛制药有限公司。

1.2 主要方法

1.2.1 HCC-827肺癌细胞的培养 用DMEM低糖培养基（含 10%FBS、1%双抗）在细胞培养瓶中培养HCC-827肺癌细胞，置培养瓶于恒温细胞培养箱中培养。当细胞瓶底部HCC-827肺癌细胞达到90%融合度时，用细胞缓冲液PBS冲洗后加入胰蛋白酶1ml，覆盖培养瓶底部的细胞消化约3min，当显微镜下细胞变为孤立球形时，终止胰蛋白酶对细胞消化，取含细胞混合液于离心管，800r/min离心6min。弃废液，加入新培养基吹打保留的细胞沉积，充分混匀，最后将含有细胞的重悬液分配于新的培养瓶中传代。

1.2.2 HCC-827肺癌细胞的瞬时转染 将HCC-827细胞种植于6孔细胞培养板上。接种第2天，待细胞融合度达到80%时，使用lipofectamine 2000脂质体与opti-MEM培养基，参考说明书，选择细胞生长状态相近的细胞分成未转染组（不进行转染处理）、空载体组（转染空载体）、miR-30b转染组（转染miR-30b质粒），每组3个副孔，其余处理相同，放于细胞培养箱中培养。5h后将原有转染培养液更换成含血清的新鲜培养基。48h后将6孔板置于荧光显微镜下观察。

1.2.3 总RNA的提取及逆转录 首先除去6孔板中原有培养基，分别加入1ml Trizol试剂，充分裂解细胞后，将混合液至1.5ml EP管中，加入0.2ml氯仿，持续震荡，充分混匀后，室温静置2～3min。低温13 000r/min，离心12min。完毕后，取上清液0.5ml至新的EP管中。加入500μl异丙醇，轻轻摇晃，放置8min。低温13 000r/min，离心12min，弃上清液。加入1ml 75%乙醇与25%DEPC处理水的混合液，混匀，在4℃，7500r/min，5min离心后，弃乙醇，干燥10min后加DEPC水重悬，重悬液进行RNA纯度的测定。microRNA逆转录试剂盒（Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit），进行cDNA的合成。

1.2.4 逆转录PCR（RT-PCR）检测miR-30b的表达按照microRNA含量测定试剂盒的手册配制15μl的PCR反应体系，在PCR仪器上进行反应，选择U6作为内参。PCR 过程：95℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 1min，共 40个循环。选用2-ΔΔCt法归纳分析所得到的数据。

1.2.5 Transwell侵袭实验 将Transwell小室置于细胞培养板内，加入基质胶。室温下静置20min，使基质胶于小室底部铺开，培养箱内恒温孵育3h。孵育完后，各小室内加200μl无血清培养基，水化20min。12h后，3组细胞分别取200μl加入各小室内，数目为1×105，在对应的24孔细胞培养板内（即小室外）加入500μl完全培养基。24h后取出小室，用细胞缓冲液PBS清洗2次，去除残留的细胞，完成甲醛固定后用结晶紫进行染色2h。2h后清除残余的结晶紫染料，置于显微镜下观察并保留图像，随机选择3个视野进行侵袭细胞计数。

1.2.6 Western blot实验 将3组细胞分别种植于6孔细胞培养板，各3孔。弃去多余的培养液，加细胞缓冲液PBS清洗各孔2次。完毕后，各孔加入足量的细胞裂解液，待充分裂解细胞后，刮下细胞并混匀，冰浴1h。待细胞悬液不再黏稠，4℃下，12 000r/min，离心25min，取上清液分装于EP管。将总蛋白按比例加入蛋白电泳用的上样缓冲液，100℃水浴加热 5min。保持实验条件的等同，综合所得的数据资料记录平均值，上述实验重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件,符合正态分布的计量资料以表示，3组比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组HCC-827肺癌细胞荧光显微镜下所见 见图1（插页）。

由图1可见，空载体组、miR-30b转染组可见绿色荧光，未转染组未见绿色荧光，表明空载体、miR-30b已经转染至HCC-827肺癌细胞内。

2.2 3组细胞转染后48h miR-30b相对表达量的比较 见图2。

图2 3组细胞转染后48h miR-30b相对表达量的比较

由图2可见，miR-30b转染组miR-30相对表达量为 6.97±0.42，显著高于未转染组 1.00±0.10、空载体组 1.15±0.09，差异有统计学意义（t=-24.08、-23.56，P＜0.05）。未转染组和空载体组miR-30b相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 3组细胞的侵袭实验显微镜下所见及结果统计见图 3（插页）。

由图3可见，Transwell侵袭实验进行24h后，3组侵袭细胞数目比较，差异有统计学意义（F=14.79，P＜0.05）。miR-30b转染组侵袭细胞的数目为157.00±10.54，与未转染组、空载体组的（195.33±10.02、192.00±7.94）比较，分别下降了19.4%，17.9%，两两比较差异有统计学意义（t=4.69、4.75，P＜0.05），表明过表达 miR-30b能显著抑制HCC-827肺癌细胞的侵袭能力。

2.4 3组细胞p-EGFR、p-AKT蛋白表达的比较 见图4。

图4 3组细胞p-EGFR、p-AKT蛋白表达的比较

由图4可见，经GAPDH内参标准化后，3组p-EGFR表达量比较，差异有统计学意义（F=130.59，P＜0.05）。miR-30b转染组p-EGFR表达量为0.57±0.02，与未转染组0.82±0.02、空载体组0.87±0.03比较，差异均有统计学意义（t=14.08、14.33，P＜0.05）。未转染组和空载体组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。3组p-AKT表达量比较，差异有统计学意义（F=2440.5，P＜0.05）。miR-30b转染组p-AKT蛋白表达量为0.32±0.01，与未转染组0.66±0.01、空载体组 0.67±0.01比较，差异有统计学意义（t=60.56、66.54，P＜0.05），未转染组和空载体组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

microRNA表达谱与肿瘤的临床和生物学特征相关，包括组织类型，分化，侵袭，治疗反应和预后[6]，因此，自microRNA被发现以来，较早是用于各种肿瘤的鉴别诊断[7-8]，亦可用于预测肿瘤患者的生存时间。越来越多证据表明这类microRNA在各种生物过程具有重要作用，研究报道其上调与下调会对细胞的增殖、生长、分化与凋亡产生影响[9-10]，换言之，它们具有类似致癌或抑癌基因的功能[11]。microRNA进行基因调控的机制是它们同参与生成蛋白质的microRNA匹配，降低microRNA生成蛋白效率或其程度以抑制相关蛋白的表达[12-13]，从而实现对基因的调控，均已被相关研究证实。下游靶基因受microRNA的调节通路而发挥生物学效应[14]，microRNA的作用表现在调控细胞的整个生命过程，包括分化和凋亡，肿瘤细胞同样接受其调控，这些microRNA可影响肿瘤细胞的侵袭和转移能力[15]。

肺癌是较常见的恶性肿瘤之一，具有较强的侵袭和转移能力，临床上其类型大多为非小细胞型，肺癌若发生早期转移往往提示预后不良。在NSCLC中大多数均存在EGFR的突变，通常EGFR表达量升高。目前早期肺癌可采用开胸或胸腔镜下外科手术切除肿瘤，治愈率较高，是目前可行的治疗肺癌的方法，但也有一定的复发率。晚期肺癌患者有脑部或者其他器官转移将失去手术机会，而化疗带给患者诸如手脚麻木、血细胞减少、神经损伤等不良反应有时让患者难以忍受，放疗对人体正常细胞产生较大的杀伤作用，放、化疗对于NSCLC的疾病化解率约1/4和1/5。晚期肺癌临床上也可以采取靶向治疗方案[16]，然而遗憾的是患者往往会产生耐药，最终的疗效不能令人满意。所以，寻找并研究其他治疗手段十分重要。

许多研究表明，多种microRNA在肺癌中存在表达异常，microRNA let-7是第一个在肺癌组织中被发现表达异常的microRNA，之后研究者陆续发现miR-126、miR-191、miR-224等microRNA在肺癌中均有表达异常。microRNAs是内源性的小片段RNA，在先天上就具有其他优势，近些年对microRNA上调及下调对肺癌的影响的研究也慢慢地成为了热点[1-2]。许多研究者试图通过改变肺癌细胞中特定microRNA的表达量来分析该中microRNA对肺癌细胞生物学特性的影响。Bai等[17]发现通过改变A549肺癌细胞中miR-196b的表达量，发现它能抑制肺癌细胞的生长和转移。Ma等[18]通过小鼠体内异种肿瘤移植实验，体外肺癌细胞实验证实miR-383对肺癌具有抑制作用。

综上所述，本研究通过将外源性携带有miR-30b基因片段的质粒导入到HCC-827肺癌细胞中，构建出过表达miR-30b的稳定细胞株，RT-PCR检测证实miR-30b转染组与未转染组、空载体组相比，miR-30b存在过表达，transwell侵袭实验证实miR-30b的过表达抑制了HCC-827肺癌细胞的侵袭能力[6]。Western blot实验检测miR-30b转染组中p-EGFR与p-AKT

的表达显著降低，表明过表达miR-30b可能通过EGFR/AKT信号通路抑制了HCC-827肺癌细胞的侵袭能力。许多研究表明多种信号通路会对肺癌起到调控作用，miR-30b通过EGFR/AKT信号通路对NSCLC的作用的机制需要进一步研究。调节microRNA表达水平,研究其对肿瘤生物学特性的改变和对相关通路的影响，为我们今后临床上克服肺癌这一难题上开启了一个新思路，为肺癌潜在的临床治愈提供了新方案。

图1 3组HCC-827肺癌细胞荧光显微镜下所见（a：未转染组；b：空载体组；c：miR-30b转染组）

图3 3组细胞侵袭实验显微镜下所见及结果统计（a：未转染组；b：空载体组；c：miR-30b转染组；d：3组细胞侵袭实验结果比较）