益气解毒中药复方对急性电离辐射小鼠骨髓损伤的防护作用

徐文慧，李盼飞，王 磊，王 安，王天琪，高明泽，胡素敏

（北京中医药大学中医学院，北京 100029）

骨髓是人体重要的造血器官，对辐射高度敏感[1]，辐射导致的骨髓抑制主要表现为血细胞数减少、感染以及出血等急性损伤，其中以骨髓造血细胞损伤为最主要特征[2]。射线直接杀伤骨髓中的造血干细胞，骨髓组织中幼稚的红、粒、巨核细胞大量死亡[3]，不能继续生成血细胞，血细胞得不到补充，血细胞计数则会持续低下。电离辐射通过直接作用、间接作用对机体产生一系列损害，最终可引发细胞周期阻滞和细胞凋亡[4-5]，导致骨髓损伤，造血障碍，免疫功能低下等。本课题组前期研究发现，预防性给予以中药为主要治法的中药复方，可以提高受照后小鼠机体的免疫功能，从而在照后早期减少炎症并发症的发生[6]。而本文主要是研究该方对急性电离辐射小鼠骨髓损伤的防护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性Balb/c小鼠，体质量18～22 g，40只，由斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供，许可证号SCXK（京）2011-0004。饲养于环境温度（20±2）℃，湿度50%±10%，按照12 h光照/12 h黑暗，自由摄食、饮水的饲养条件喂养，实验前适应性饲养3 d。

1.2 实验仪器 BD FASC antoII型流式细胞仪，美国BD公司产品；JY203电子天平，上海浦春计量仪器有限公司产品；冷藏冰箱、超低温冰箱，海尔电器有限公司产品；5417R小型台式高速离心机，德国Eppendorf公司产品；台式冷冻离心机，湘仪检测设备有限公司产品；MP5002型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品。THZ-D型台式恒温振荡器，太仓市实验设备厂产品。MK3型酶标仪，热电（上海）科技仪器有限公司产品。摇床，其林贝尔仪器制造有限公司产品。

1.3 实验试剂 PBS磷酸盐（批号：No.529G021），北京索莱宝科技有限公司产品。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒（批号：4293719）、FITC Rat Anti-Mouse CD34（批号：3331656）、PE Rat lgG2a k Isotype Control（批号：3130649）、FACS Lysing Solution（批号：3281668），美国BD公司产品。Mouse TNF-α Sunny ELISA Kit（批号：228251055），联科生物技术有限公司产品。

1.4 药物制作方法 中药复方的中药饮片均购自北京同仁堂蓝色港湾店，经临床中药学教研室老师鉴定为真品，由本实验室自行制备成水煎液。中药复方煎煮2次，合并药液，浓缩至原药材的1～2 g/mL，60%乙醇除杂。给药剂量为人临床用量的10倍（即人临床等效量），药物浓度为 0.686 g/mL。盐酸小檗胺片，由四川中方制药有限公司提供，批号：150501。用去离子水溶解，给药剂量为人临床等效用量2.4 mg/mL。

1.5 动物分组、造模及给药方法 小鼠在SPF级动物室中喂养3 d后，按照体质量随机分为4组，每组10只，分别为正常组、模型组、小檗胺组、中药组。正常组，灌胃去离子水，0.2 mL/10 g体质量；模型组，灌胃去离子水，0.2 mL/10 g体质量；小檗胺组，灌胃小檗胺水溶液，0.2 mL/10 g体质量；中药组，灌胃相应药液，0.2 mL/10 g体质量，均灌胃14 d。第14天灌胃后，除空白组小鼠外，其他各组小鼠进行一次性全身60Coγ射线照射，建立急性辐射损伤模型。照射采用北京大学化学与分子工程学院钴源，将小鼠固定于带气孔的树脂鼠笼中，对小鼠进行全身一次性60Coγ射线照射，照射剂量为3.5 Gy，照射剂量率为0.455 Gy/min。各组照射后不再灌胃给去离子水或药物，照射后第4天取材。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 外周血细胞计数 小鼠摘眼球取全血80 μL，用EDTA-K2抗凝，于全自动血细胞分析仪检测外周血细胞数，包括白细胞数（WBC）、红细胞数（RBC）、血红蛋白浓度（HGB）、血小板数（PLT）。

1.6.2 骨髓组织病理检查 每组取6只小鼠胸骨，置于10%中性福尔马林中固定24 h后，浸泡在脱钙液中脱钙，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制备4 μm石蜡切片，60℃烘箱烤片，HE染色。然后在显微镜下观察骨髓造血组织病理变化。

1.6.3 骨髓CD34+细胞检测 每组选取6只小鼠，分别剥取股骨，用注射器套上的7号针头吸取1 mL的PBS液反复冲洗骨髓，将骨髓细胞冲入1.5 mL离心管中离心，离心条件为300×g，4℃，5 min。去上清，加PBS液至0.5 mL，混匀，制备成单个骨髓细胞悬液。取120 μL骨髓细胞混悬液，加入CD34抗体3 μL抗体，室温下避光反应15 min。加入1 mL 1☓的红细胞裂解液，混匀，裂解10 min，直至透亮，室温离心300×g，5 min。吸去950 μL上清，加入1 mL PBS，混匀，室温离心300×g，5 min。加200 μL PBS后流式细胞仪检测。

1.6.4 骨髓细胞周期检测 取上述骨髓细胞混悬液180 μL，加上420 μL的冰冷的无水乙醇固定。加冰冷的0.6 mL PBS，离心300×g、4℃、5 min，去上清，加1 mL PBS，离心300×g，4℃、5 min，去上清。加200 μL PBS，加RNA酶A（1 mg/mL）至终浓度为50 μg/mL，37 ℃孵育40 min，加入PI至终浓度为20 μg/mL（约5 μL），5 min后流式细胞仪检测。1.6.5 骨髓细胞凋亡检测 将1.6.3的骨髓细胞混悬液 120 μL，加入 1 ☓ Binding Buffer 100 μL，混匀。加入3 μL FITC，轻轻吹打，室温避光孵育15 min。加入3 μL PI，立即避光，流式细胞仪检测，上机前再加入 100 μL 1 ☓ Binding Buffer。

1.6.6 外周血TNF-α检测 取小鼠血清，按照ELISA试剂盒说明检测血清中TNF-α含量。

1.7 数据分析 实验结果以均数±标准差（x± s ）进行统计描述，采用 SPSS 17.0 统计软件进行分析。组间比较用独立样本的t检验。对于本实验指标如白细胞数等，正常组与各照射组数据相差很大，在比较时采用正常组与模型组比较，确定模型是否成功，然后单因素方差比较统计各照射组组间差异。所有的统计检验均采用双侧检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血细胞计数 照射后4 d，与空白组比较，模型组小鼠外周血白细胞数、红细胞数及血红蛋白浓度均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.001）。与模型组相比，小檗胺组外周血红细胞数显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01），中药组白细胞数、红细胞数及血红蛋白浓度升高，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。

表1 小鼠外周血细胞计数（x± s ，n = 10）

2.2 骨髓组织病理检查 正常组胸骨骨髓增生活跃，红系、粒系、巨核系造血干细胞明显。模型组胸骨骨髓增生低下，三系造血干细胞明显减少，血管扩张、充血，脂肪细胞增多，骨髓脂肪化明显，血管大量出血。小檗胺组胸骨骨髓增生低下，三系造血干细胞明显减少，血管扩张、充血，脂肪细胞增多，骨髓脂肪化明显，血管大量出血，较模型组稍好。中药组胸骨骨髓增生稍有低下，三系造血干细胞明显，骨髓稍有脂肪化，较模型组有明显改善，好于模型组。见图1（见插页一）。

2.3 骨髓CD34+细胞检测 照射后4 d，与空白组比较，模型组小鼠骨髓CD34+细胞比率有降低趋势。预给药干预后，小檗胺组、中药组骨髓CD34+细胞比率较模型组有增多趋势，差异无统计学意义。见表2，图2（见插页一）。

2.4 骨髓细胞周期检测 见表3，图3（见插页一）。结果显示，照后后4 d，与空白组相比，模型组 G0/G1期细胞比例降低，而 S 期细胞比例升高，G2/M期细胞比例减少，提示照射后4 d引起小鼠骨髓干细胞发生S期延迟。与模型组相比，小檗胺组、中药组 G0/G1期细胞比例有升高的趋势，S期细胞比例有降低趋势，G2/M期细胞比例有升高趋势。

2.5 骨髓细胞凋亡检测 照射后4 d，与空白组比较，模型组、小檗胺组、中药组小鼠骨髓细胞早期、晚期、总凋亡率均升高，预给药干预后，小檗胺、中药复方有减少骨髓细胞凋亡的作用趋势，但不具有显著性差异。见表4。

表2 CD34+细胞比率（x± s ，n = 6）

表3 小鼠骨髓细胞周期（x± s ，n = 6） %

表4 小鼠骨髓细胞凋亡（x± s ，n = 6）

2.6 外周血TNF-α检测 照射后4 d，与空白组比较，模型组外周血TNF-α明显升高（P＜0.05）， 预给药干预后，小檗胺、中药组小鼠均有使外周血TNF-α降低的趋势，其中中药方能明显降低小鼠外周血TNF-α水平，有显著统计学意义（P＜0.001）。

表5 小鼠外周血TNF-α含量（x± s ，n = 10） pg/mL

3 讨论

骨髓是机体对电离辐射高度敏感的器官之一[7]，电离辐射发生后，其突出的不良反应是骨髓抑制及白细胞减少[8]。辐射导致骨髓造血功能严重受损，造血细胞有丝分裂停止，细胞更新中断，反映在外周血象中则表现为白细胞、红细胞数量迅速下降和血红蛋白浓度的降低，其中白细胞对射线高度敏感。故外周血细胞计数可反映骨髓的造血功能[9]，白细胞数量的改变能够反映辐射损伤的严重程度[10]。

CD34抗原是一种阶段特异性白细胞分化抗原[11]，阳性表达于造血干细胞和祖细胞表面[12]，正常人骨髓低密度单个核细胞中CD34+细胞约占1.5%[13]，并随着骨髓干细胞的分化成熟而逐渐减少直至消失[114]。小鼠骨髓中CD34+细胞的比例,可反映骨髓中造血干祖细胞的数量[15]。

电离辐射通过诱导细胞周期G1期阻滞、G2期阻滞、S 期延迟及S/M解偶联，从而影响细胞周期进程[4]。机体内有一系列的适应机制保护细胞免受损伤，多种有害刺激如射线，可以打破氧化应激的平衡状态，促使细胞凋亡甚至导致病理损伤[16]。骨髓中分裂增生能力旺盛的造血干祖细胞受到辐射后发生细胞周期阻滞，这是机体对外界刺激的一种保护性反应，此时可提供充足的时间对辐射损伤的DNA进行修复，但损伤严重者通过G1期永久性阻滞或被诱导凋亡而清除掉。

造血干祖细胞的增殖分化受到体液因子的调控，负向调控的因子对造血干祖细的增殖分化有不同程度的抑制作用[17]。辐射损伤促进了负调控因子TNF-α的表达，使之对造血系统产生负性调控，抑制造血细胞增殖，诱导细胞凋亡[17-18]。TNF-α主要由活化的巨噬细胞、NK细胞及T淋巴细胞产生，具有免疫调节作用[19]。有报道显示，辐射可诱导肿瘤坏死因子α（TNF-α）的过度表达，而TNF-α又可影响骨髓微环境，诱导骨髓细胞凋亡[20]。

本研究表明，中药复方能显著升高白细胞数、红细胞数及血红蛋白浓度，同时病理切片显示出对骨髓损伤的保护作用，说明中药复方能够有效的防护电离辐射所致的骨髓损伤。辐射后负向调控因子如TNF-α的过度表达加剧了骨髓抑制，而照射前小鼠灌胃益气解毒中药复方，结果显示能够很好的防护骨髓，其中的机制之一可能是通过降低外周血中TNF-α水平对抗其对骨髓造血功能的负性调控。中药复方对照射后第4天小鼠骨髓的细胞周期和细胞凋亡影响不明显，CD34+细胞百分比也未见统计学差异，说明在中药复方虽然对辐射所致的骨髓损伤有一定的防护作用，但是照射后第4 天的实验结果还不能支持其防护机制是通过延缓骨髓细胞周期阻滞，降低细胞凋亡率来实现的，其中深入的机制还需进一步探索。