不同免疫程序对猪流行性腹泻疫苗免疫效果的影响

王艳丰，张丁华，王书丽，刘守铉，李爱心，桂启胜

(1.河南农业职业学院牧业工程学院，河南中牟451450 ； 2.河南省畜牧局，河南郑州450002 ；3.河南豫正生物科技有限公司，河南中牟451450)

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种猪的急性肠道传染病，临床特征为呕吐、腹泻、脱水和哺乳仔猪高死亡率。自2010年10月以来，PED在我国一直大面积暴发。2013年以后，PED暴发导致美国猪肉生产商每年损失9亿至18亿美元[1]，韩国40%的猪场受到影响，给生产者造成巨大经济损失[2]。

目前，对于PED尚无有效治疗药物，选择合适的疫苗及合理的免疫程序是预防PED的重要措施。商品化的疫苗主要有猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗，猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5型)三联活疫苗，猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗3种。但不同的疫苗对猪免疫效果会存在一定的差异，本试验通过不同免疫程序对PED黏膜免疫水平影响的研究，旨在探索该病的最佳免疫程序，为PED的有效防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要仪器与设备 全自动酶标仪；高压灭菌锅；恒温培养箱；4 ℃冰箱；超净工作台；5 mL、10 mL一次性注射器；微量移液器等。

1.1.2 主要试剂和疫苗 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(简称猪腹泻二联灭活苗);猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒CV777株+NX株，简称猪腹泻三联活疫苗)，均为市售正规疫苗；猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒，韩国安捷Bionote公司生产。

1.2 试验猪场与试验设计 2016年9月至2017年5月，选取河南省内8个存栏母猪50～500头的猪场，每个猪场母猪随机分为2组(试验组Ⅰ、试验组Ⅱ)。免疫程序：2次猪腹泻二联灭活苗组(产前40 d、20 d)、2次猪腹泻三联活疫苗组(产前40 d、20 d)、2次猪腹泻三联活疫苗(产前60 d、40 d)+1次猪腹泻二联灭活苗(产前20 d)组、1次猪腹泻三联活疫苗组(产前40 d)+1次猪腹泻二联灭活苗(产前20 d)组。具体试验分组与免疫程序见表1。试验疫苗用法与用量：猪腹泻二联灭活疫苗，妊娠母猪于产前40 d、20 d后海穴各注射1次，每次4.0 mL；猪腹泻三联活疫苗，妊娠母猪于产前40 d、20 d后海穴各注射1次，每次1.0 mL。母猪产仔当天收集乳汁2 mL，用ELISA方法检测初乳中IgA抗体值，最后取平均值。

表1 8个试验猪场的分组与免疫程序

1.3 检测指标与方法 按照PED IgA ELISA抗体检测试剂盒说明书对所有试验母猪初乳中PED IgA抗体进行检测。(1)检测的有效性：①阴性对照平均OD450/620nm值<0.200；②阳性对照平均OD450/620nm值>0.500，上述任何一个值超出规定的范围，则该试验被视为无效，所检的样品需要重新进行检测；(2)计算判断值：①用A1和B1孔的吸光值来计算阴性对照的平均OD450/620nm值，判断值=(0.35+阴性对照的平均OD450/620nm值)；②根据阴性对照的OD450/620nm值，样品结果的判断标准如下：阳性结果：样品OD450/620nm值>判断值；阴性结果：样品OD450/620nm值<判断值。

2 结果与分析

2.1 不同猪场母猪乳汁中IgA抗体水平 对收集自河南省8个猪场接种过PED疫苗的母猪942份初乳样品，利用PEDV IgA ELISA抗体检测试剂盒进行检测，结果显示，不同地区猪场母猪初乳中PED IgA抗体检测结果存在较大差异，以2次猪腹泻三联活疫苗+1次猪腹泻二联灭活苗免疫组抗体水平最高，3组抗体阳性率均达到100%，猪腹泻三联活疫苗单独或与猪腹泻二联灭活苗组合使用，抗体平均阳性率(97.79%)高于猪腹泻二联灭活苗组(90.69%)。采用相同免疫程序的猪场也存在较大差异，如2次猪腹泻二联灭活苗的8个猪场，抗体阳性率从85.71%至100%不等，1次猪腹泻二联灭活苗+1次猪腹泻三联活疫苗的2个猪场抗体阳性率分别为92.86%、93.06%，表明PED疫苗免疫效果会受到猪场饲养管理水平、营养、免疫程序、应激等诸多因素的影响。具体结果见表2。

2.2 不同免疫程序的IgA抗体阳性率与阳性平均OD值 免疫程序不同，初乳中IgA抗体与阳性平均OD值也不同。抗体阳性率和阳性平均OD值最高的为2次猪腹泻三联活疫苗+1次猪腹泻二联灭活苗免疫程序组，其次是2次猪腹泻二联活疫苗组，最低的为2次猪腹泻二联灭活苗组。具体结果见表3。

表2 不同猪场母猪乳汁中IgA抗体检测结果

表3 不同免疫程序的IgA抗体阳性率与阳性平均OD值

3 讨论

PEDV的免疫主要依靠黏膜免疫(SIgA)，研究表明，高水平的母源SIgA抗体与保护仔猪抵抗PEDV感染有关，而与血液中的中和抗体无相关性[3]。因此，如何刺激动物机体产生高效价的分泌型IgA抗体，是疫苗免疫以及PED防治的关键。

本试验通过猪腹泻二联灭活苗、猪腹泻三联活疫苗的单独及组合使用，不同免疫程序对母猪初乳中IgA抗体水平影响的研究，结果表明，2次猪腹泻三联活疫苗+1次猪腹泻二联灭活苗的免疫效果最好，但成本相对于2次猪腹泻二联灭活苗偏高，其次是2次猪腹泻三联活疫苗和1次猪腹泻二联灭活苗+1次猪腹泻三联活疫苗，这与王娟萍等[4]、刘从敏等[5]报道一致，最后是2次猪腹泻二联活疫苗，但胡兴义等[6]报道单一接种猪腹泻三联活疫苗或猪腹泻二联灭活苗的免疫效果远不如两种疫苗交替接种的效果好。2014年前在我国各猪场使用的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗，使用的是经典CV777株，免疫效果较好，但2015年以后防控效果有所下降，这可能与PEDV毒株发生变异，导致毒力增强有关[7- 8]。

研究表明，PEDV感染机体后，主要的靶器官是肠、肠系膜淋巴结和肺，且感染时间早、持续时间长，从而会导致消化器官严重的病理损伤[9]，因此，肠道黏膜免疫中SIgA抗体尤为重要。猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒CV777株+NX株)于2015年后实现商品化上市，属于弱毒疫苗。通过后海穴注射疫苗，尤其是弱毒活苗，可刺激母猪产生大量IgA抗体分泌到乳汁中形成SIgA抗体，从而为乳猪提供被动免疫保护[10]。

综上所述，结合河南省实际情况和本研究结果，再考虑到疫苗费用，推荐猪场猪流行性腹泻的免疫程序为：妊娠母猪产前40 d、20 d各免疫1次猪腹泻三联活疫苗，其所生仔猪3日龄时再免疫1次；或产前40 d、20 d分别免疫1次猪腹泻三联活疫苗和猪腹泻二联灭活苗。此外，妊娠母猪也可产前60 d、40 d各免疫1次猪腹泻三联活疫苗，产前20 d后海穴注射猪腹泻二联灭活苗或产前40 d、20 d各免疫1次猪腹泻三联活疫苗，同时肌肉注射猪腹泻二联灭活苗。同时，要注意加强对后备猪、种公猪及仔猪进行免疫。