衰老对小鼠肠黏膜上皮屏障功能影响的实验研究①

王汉琨 张 丁 宋 莉 于 莉 宋银宏 王德成

(三峡大学医学院/三峡大学感染与损伤研究所，宜昌443002)

肠道作为机体抵御病原体的第一道屏障，包括上皮屏障、生物屏障、免疫屏障和化学屏障四个部分，是保护人体抵御病原体入侵的重要防线[1]。衰老过程中人体的先天性和适应性免疫系统功能都会显著下降，尤其对肠道免疫功能的影响较大，进而导致肠道的吸收功能和黏膜免疫功能都会发生一系列的改变[2]，这是引起老年人肠道疾病高发的原因之一。有研究表明[3]，老年人肠道蠕动变慢、大小便失禁，肠胃炎相关疾病的患病率较高，给老年人正常的生活造成了极大的困扰。小鼠一般寿命为18个月左右，其生长过程约分为三个阶段：1～2月龄为性成熟期，2～6月龄为青年期，6月龄之后就逐渐进入衰老期，有较多研究选取12月龄到15月龄小鼠为衰老小鼠[4]。通过文献检索发现衰老对小鼠肠道影响的相关文献较少，因此，本实验选取1月龄、6月龄、10月龄，12月龄小鼠研究其肠道形态学变化、肠道黏膜免疫相关细胞数量的变化，以及小鼠小肠组织中Occludin的表达变化，探讨衰老对小鼠肠道形态结构和免疫屏障功能的影响，并且提供部分理论依据。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂 脱水机(TP1020)、超薄切片机(ULTRACUTR)购自Leica公司(德国)；摊片烤片机(CS-V1)购自宏业医用(病理)仪器有限公司(湖北孝感)；Olympus BX53显微镜、cellSens Entry图像采集系统购自Olympus公司(日本)；小鼠单克隆抗体Occludin购自Santa Cruz；兔抗鼠二抗、DAB试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；雄性SPFC57BL/6小鼠购自三峡大学实验动物中心。

1.2方法

1.2.1动物实验方法 雄性SPF级C57BL/6小鼠32只，由三峡大学实验动物中心提供。按不同生长阶段分为1月龄组、6月龄组、10月龄组、12月龄组，各组8只。小鼠被处死前禁食24 h，自由饮水。使用10%水合氯醛麻醉小鼠后处死，快速打开腹腔，取十二指肠、空肠、回肠各1 cm，使用生理盐水清洗干净，放入包埋盒中，固定于4%多聚甲醛中，放入4℃冰箱24 h，之后组织放入半自动脱水机脱水。组织包埋，半自动切片机制备切片，厚4 μm，每个蜡块切取5张切片，黏附在载玻片上，65℃烤箱烤4～6 h，装入切片盒备用。

1.2.2组织染色和检测方法 HE染色：常规二甲苯脱蜡，苏木精复染3 min，流水冲洗30 min，伊红染色1 min，盐酸酒精分化，常规梯度酒精脱水至透明，自然风干，中性树胶封片。

PAS染色：常规二甲苯脱蜡，1%高碘酸染色10 min，流水冲洗5 min，双蒸水冲洗，之后加入schiff试剂，避光反应10 min，流水冲洗5 min，双蒸水中静置10 min，苏木精复染，自来水润洗10 min，盐酸酒精分化，常规梯度酒精脱水，自然风干，中性树胶封片。

甲苯胺蓝染色：常规二甲苯脱蜡，蒸馏水润洗3次，0.1%甲苯胺蓝染液浸染30 min，自来水润洗5 min，1%冰醋酸分化，常规梯度酒精脱水，自然风干，中性树胶封片。

Olympus BX53显微镜下观察，使用cellSens Entry图像采集系统拍照，每只小鼠十二指肠、空肠、回肠切片各取20个不连续视野，每个视野中选取5根排列整齐且形态较好的肠绒毛，使用Image-Pro Plus6.0病理图像分析软件，参照周一珺等[5]的方法测量绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度；参照陈静等[6]和Mahadeva等[7]的统计方法统计淋巴细胞、杯状细胞数量；苯胺蓝染色统计肥大细胞数量。

免疫组织化学染色：常规二甲苯脱蜡，柠檬酸盐水溶液水浴修复30 min,之后冷却至室温，双蒸水润洗，3%H2O237℃孵育箱内孵育15 min，5%小牛血清室温封闭60 min，滴加一抗4℃冰箱内孵育过夜，二抗室温湿盒内孵育60 min，DAB显色 1 min，苏木精复染10 s，盐酸酒精分化，常规梯度酒精脱水，自然风干，中性树胶封片。Olympus BX53显微镜下观察，使用cellSens Entry图像采集系统拍照。使用Image-Pro Plus6.0图像分析软件进行光密度分析，计算阳性率(IOD)。

2 结果

2.1不同月龄小鼠小肠黏膜层形态变化

2.1.1小肠绒毛高度 HE染色结果表明，相同月龄，十二指肠到回肠的绒毛长度呈依次降低趋势。随着月龄的增高，十二指肠、空肠、回肠各组的绒毛长度逐渐降低(P<0.05)。见表1。

2.1.2小肠绒毛宽度 HE染色结果表明，十二指肠6月龄组绒毛最宽，1月龄组到6月龄组呈增高趋势，6月龄组到12月龄组绒毛长度逐渐降低(P<0.05)；空肠和回肠各组绒毛宽度逐渐降低(P<0.05)。见表1。

2.1.3小肠隐窝深度 HE染色结果表明，十二指肠的隐窝宽度呈增高趋势(P<0.05)。空肠和回肠的隐窝宽度呈先增高后降低趋势(P<0.05)。见表1。

2.2不同月龄小鼠小肠上皮淋巴细胞数量变化 HE染色后光镜下观察，上皮内淋巴细胞主要分布于肠绒毛上皮细胞之间，多数位于上皮细胞基膜附近，少量见于上皮游离面。该细胞较小，胞核大而圆、深染(图1箭头指示)，胞浆较少，见图1A～D。同一肠段，不同月龄淋巴细胞数量呈先升高后降低趋势，且6月龄组小鼠小肠各段上皮内淋巴细胞最多(P<0.05)。见表2。

2.3不同月龄小鼠小肠上皮杯状细胞数量变化 PAS染色光镜下观察，杯状细胞分散于柱状细胞之间，经PAS染色后呈鲜红色(图2箭头指示)，其顶部胞质为大量糖原颗粒拥塞而膨隆，见图2A～D。随着月龄的增高，十二指肠、空肠、回肠各组的杯状细胞数量逐渐降低(P<0.05)。见表3。

2.4不同月龄小鼠小肠肥大细胞数量变化 苯胺蓝染色光镜下观察肥大细胞为蓝紫色， 主要分布在肠壁固有层中(图3中箭头指示)，细胞呈现圆形或者椭圆形，也有个别呈现梭形，见图3A～D。随着月龄升高，十二指肠、空肠、回肠各组的肥大细胞数量呈先增高后降低趋势(P<0.05)。见表4。

GroupsDuodenumJejunumIleumVillous height1 month736.07±47.83650.98±39.89420.43±16.186 months635.78±77.90573.87±61.01366.25±27.511)10 months546.95±54.021)482.27±37.611)302.19±32.471)12 months476.47±19.301)377.12±21.001)266.19±15.751)Villous width1 month119.76±8.76127.11±10.69112.47±8.576 months153.98±19.901)114.58±10.8699.55±7.8510 months133.46±5.76112.35±6.8599.38±13.4812 months121.66±13.702)103.67±6.311)93.33±5.371)Crypt depth1 month135.94±20.47161.57±21.63168.76±17.286 months189.07±26.85212.01±31.061)199.07±24.2710 months195.59±25.091)201.09±28.66192.96±20.2612 months214.22±3.461)190.91±9.92189.35±16.79

Note：Compared with 1 month,1)P<0.05;compared with 6 months,2)P<0.05.

图1 不同月龄小鼠小肠上皮内淋巴细胞数量Fig.1 Small intestine intraepithelial lymphocytes in mice of different months of ageNote: A.1 month group；B.6 months group；C.10 months group；D.12 months group(×200).

2.5免疫组化检测不同月龄小鼠黏膜组织中的Occludin蛋白 光电显微镜下观察，在1月龄组和6月龄组小鼠肠黏膜上皮细胞间可见大量棕黄色或者棕褐色的Occludin蛋白表达(图4中箭头指示)；10月龄组小鼠肠黏膜上皮细胞内可见少量棕黄色或者棕褐色的Occludin蛋白表达；而12月龄组小鼠肠黏膜上皮细胞内棕黄色或者棕褐色的Occludin蛋白表达更为少见。12月龄组和10月龄组与6月龄组相比，小肠黏膜内Occludin蛋白表达明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图4。

GroupsDuodenumJejunumIleum1 month6.13±0.587.26±0.487.66±0.766 months10.19±0.641)11.73±0.581)11.41±0.681)10 months9.54±0.231)10.44±0.611)2)9.93±0.571)2)12 months7.89±0.251)2)9.62±0.851)2)8.64±0.622)

Note：Compared with 1 month,1)P<0.05;compared with 6 months,2)P<0.05.

GroupsDuodenumJejunumIleum1 month8.40±0.939.30±0.6711.79±0.736 months8.00±0.848.90±0.488.65±0.841)10 months7.90±1.088.67±0.868.44±0.711)12 months7.70±1.028.62±0.128.25±0.391)

Note：Compared with 1 month,1)P<0.05.

GroupsDuodenumJejunumIleum1 month2.68±0.652.18±0.421.86±0.476 months6.45±1.711)5.75±0.871)5.45±0.611)10 months4.78±0.891)2)4.77±0.411)4.15±0.381)2)12 months2.33±0.142)2.27±0.572)1.65±0.622)

Note：Compared with 1 month,1)P<0.05;compared with 6 months,2)P<0.05.

图2 不同月龄小鼠小肠上皮内杯状细胞数量Fig.2 Intestinal epithelial goblet cells in mice of different months of ageNote: PAS staining A.1 month group;B.6 months group;C.10 months group;D.12 months group (×200).

图3 不同月龄小鼠小肠肥大细胞数量Fig.3 Small intestine mast cells in mice of different months of ageNote: Aniline blue staining.A.1 month group;B.6 months group;C.10 months group；D.12 months group (×400).

3 讨论

机体衰老伴随有肠黏膜免疫功能下降、肠道通透性以及肠道微生物群的变化[8]，随着机体衰老，小肠的形态结构和免疫功能会发生一系列改变，进而导致许多肠道相关疾病发生发展。本研究选取小鼠自然衰老模型，观察1月龄、6月龄、10月龄、12月龄小鼠小肠不同部位，研究其形态学改变，黏膜免疫相关细胞数量变化及紧密连接蛋白Occludin的表达分布情况。

小肠黏膜形态结构的完整性影响其正常功能的发挥，而小肠绒毛长度、绒毛宽度、隐窝深度等则是衡量小肠黏膜完整性的关键指标。本研究显示，随着月龄增加，小鼠小肠各段绒毛高度均呈降低趋势。空肠和回肠绒毛宽度从1月龄组到12月龄组呈下降趋势；十二指肠绒毛宽度1月龄组到6月龄组呈增长趋势，且6月龄组绒毛宽度最宽，6月龄组到12月龄组呈下降趋势。结果表明，小肠绒毛的高度和宽度会随着年龄的增加发生一定的改变，影响小肠的消化吸收功能。有研究表明，隐窝深度变浅代表小肠细胞分化率变高，分泌能力和化学消化能力得到了加强[9]。本研究结果显示，空肠和回肠的隐窝深度由1月龄组到6月龄组呈升高趋势，6月龄组到12月龄组逐渐降低，而十二指肠隐窝深度从1月龄组到12月龄组呈增长趋势。Ren等[10]对大鼠衰老模型肠道形态结构变化的研究发现，衰老大鼠的回肠绒毛高度、绒毛宽度、黏膜层厚度相比于青年大鼠均显著降低，与本研究结果基本一致。肠黏膜上皮是人体代谢活动非常活跃的地方，因此肠道形态结构的变化可能与肠黏膜细胞自我更新中细胞凋亡增加相关[11]。

图4不同月龄小鼠小肠黏膜上皮细胞间Occludin蛋白的表达(×400)

Fig.4ExpressionofOccludinproteininintestinalepith-elialcellsofmiceatdifferentmonthsofage(×400)

Note: A.1 month group；B.6 months group；C.10 months group；D.12 months group.n=8;compared with 6 months,*.P<0.05;**.P<0.01.

肠道屏障可防止肠道内的有害物质和病原微生物进入体内环境，是维持机体内环境稳定的重要防线[12]。肠黏膜上皮淋巴细胞、杯状细胞、肥大细胞在肠道免疫中起到重要作用。肠黏膜上皮内淋巴细胞是肠道屏障中最先接触病原体的免疫功能细胞，并且通过分泌免疫相关细胞因子来发挥免疫调节作用[13]，上皮内淋巴细胞越多，说明肠道防御能力越强。本研究发现，6月龄组到12月龄组肠黏膜上皮内淋巴细胞逐渐减少，但6月龄组相比1月龄组淋巴细胞数量增多，可能是由于1月龄小鼠免疫系统还未完全发育成熟，淋巴细胞数量较少，本实验研究结果与Suzuki等[14]的结果基本一致。随着逐渐老化，小肠黏膜上皮内淋巴细胞减少，导致肠道内病原微生物的大量繁殖，进而可大大增加老年人肠道感染的几率。杯状细胞是肠黏膜上皮中的黏液分泌细胞，其细胞内含有大量黏液颗粒，分泌的黏蛋白附着于肠道黏膜上，对肠道起到保护和润滑的作用。肥大细胞则参与了肠黏膜的免疫调节，当其被外界病原刺激活化后，大量释放炎症介质，分泌免疫细胞因子，进而影响机体发生多种免疫反应[15]。本研究结果发现，随着小鼠月龄增加，肠黏膜上皮内杯状细胞数量逐渐减少，而肥大细胞数量从6月龄之后逐渐减少，在一定程度上说明衰老过程中小鼠小肠黏膜的免疫防御功能降低。

肠黏膜上皮细胞紧密连接的相关蛋白是构成肠黏膜上皮屏障的重要基础，由跨膜蛋白和胞质蛋白组成，其中跨膜蛋白主要有Occludin蛋白、Claudin蛋白、紧密连接分子等；胞质蛋白主要有ZO-1、ZO-2等蛋白。一旦紧密连接蛋白数量和分布发生变化，则说明肠黏膜紧密连接结构遭到破坏，肠黏膜通透性增加[16]。本研究结果显示，Occludin蛋白6月龄组表达最多，且随月龄升高而表达降低。衰老过程中，肠道可表现出一种慢性、低度的炎症状态[17]，相关炎症因子表达的增加可引起Occludin蛋白表达的减少、结构受损、肠黏膜通透性增加，屏障功能降低[18]。

综上所述，衰老过程中小鼠小肠黏膜形态结构发生一定的改变，上皮淋巴细胞、杯状细胞、肥大细胞数量减少，紧密连接Occludin蛋表达量减少，这些变化都与老年人消化道疾病发生发展息息相关。因此，深入研究机体衰老过程中小肠形态结构和免疫功能的变化及发生机制具有重大意义。