沉默HIF-1α表达逆转缺氧诱导肝癌免疫抑制的实验研究

李 伟 刘 娜 孙巨勇 姚新洁 李庆禄 李新国

(哈励逊国际和平医院检验科，衡水053000)

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率分别位居恶性肿瘤第四位与第二位[1]。大多数恶性肿瘤在发生发展过程中，通常伴随着部分内部肿瘤组织存在缺氧现象[2]。研究表明，缺氧是实体肿瘤的特征之一，缺氧有助于肿瘤内的免疫抑制，帮助癌细胞逃避免疫攻击及抑制免疫杀伤功能[3]。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是癌细胞在缺氧条件下诱导产生的一种核转录因子，与肿瘤生长、血管形成、侵袭转移密切相关[4,5]。陆晔斌等[6]研究发现，在胰腺癌中HIF-1α可能负调控MICA/B的表达，进而参与低氧对胰腺癌免疫抑制的调控。肝癌组织中HIF-1α表达异常增高，且与患者的无瘤生存时间密切相关[7]。然而，在肝癌中HIF-1α是否参与缺氧诱导的免疫抑制仍不完全清楚。本研究将通过缺氧诱导小鼠荷瘤模型，研究缺氧组织中HIF-1α及相关肿瘤免疫因子表达，构建沉默HIF-1α小鼠Hepa1-6细胞移植瘤模型，观察敲减HIF-1α后肿瘤浸润免疫细胞及免疫因子表达变化，以期揭示缺氧诱导肝癌免疫逃逸的分子机制，为临床寻找诊治恶性肿瘤方法提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料 小鼠肝癌细胞Hepa1-6购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，健康SPF级C57BL/6小鼠，体重18～22 g，购自上海实验动物中心；胎牛血清、DMEM培养基为美国Gibco公司产品；HIF-1α、GAPDH抗体购自CST公司；FITC-CD4小鼠抗体、APC-CD25小鼠抗体和PE-Foxp3小鼠抗体购自eBioscience公司；TRIzol、Script Ⅱ reverse transcriptase逆转录试剂盒、2×SYBR green master mix试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 小鼠肝癌细胞Hepa1-6采用含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM完全培养基，于37℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养。

1.2.2细胞稳定株筛选 将化学合成的shHIF-1α核苷酸序列克隆至pLKO.1-puro质粒中，构建敲减HIF-1α慢病毒载体pLKO.1-shHIF1α，并包装慢病毒。取适量对数生长期的Hepa1-6细胞接种于6孔板中，待培养过夜达30%时，加入慢病毒感染细胞，20 h后换新鲜培养液，继续培养至48 h，培养液中加入1 μg/ml的嘌呤霉素溶液进行筛选，每隔2 d更换新鲜培养液，约1个月后，对细胞进行鉴定并保种。敲减HIF-1α的核苷酸序列为：5′-CTG ATG ACC AGC AAC TTG A-3′。

1.2.3皮下移植 取6周龄SPF级C57BL/6小鼠20只，将对数生长期Hepa1-6细胞，消化后用无血清DMEM稀释成1×107ml-1，注射器吸取200 μl接种于小鼠右腋皮下。将小鼠随机分为2组，常氧饲养组和缺氧饲养组，常氧饲养条件:21%O2、5%CO2、74%N2;缺氧饲养条件:10%O2、5%CO2、85%N2;缺氧饲养采用12/12 h昼夜循环方式，缺氧时间具体为:早8:00～晚20:00[8]。

另取20只C57BL/6小鼠，随机分为2组，每组10只，将Control和shHIF-1α细胞消化稀释1×107ml-1，注射器吸取200 μl接种于小鼠右腋皮下，分别记为Control组和shHIF-1α组。约6周后，将小鼠安乐死并收集所有的移植瘤用于免疫细胞分析或基因表达分析。

1.2.4免疫组化分析 小鼠处死前1 h腹腔注射60 mg/kg 的缺氧探针HypoxyprobeTM-1，根据试剂盒说明书，经免疫组化染色分析其表达和分布区域。另采用免疫组化法检测小鼠移植瘤组织HIF-1α表达情况，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

1.2.5qPCR检测 取移植瘤组织采用TRIzol试剂提取各组总RNA，Nanodrop 2000测各组RNA浓度，并按照Script Ⅱ reverse transcriptase逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA，采用2×SYBR green master mix试剂盒qPCR检测各组细胞肿瘤抑制因子IFN-γ、IL-12b和CXCL10以及肿瘤促进因子IL-10、IL-1β和IL-17相对表达量[9-12]。引物如下：IFN-γ：F-5′-TTT GAG GTC AAC AAC CCA CAG GTC-3′、R-5′-TTT CCG CTT CCT GAG GCT GGA TT-3′；IL-12b：F-5′-GGA AGC ACG GCA GCA GAA TA-3′、R-5′-AAC TTG AGG GAG AAG TAG GAA TGG-3′；CXCL10:F-5′-TGC AAG TCT ATC CTG TCC GCA TGT-3′、R-5′-CCT TCT TTG GCT CAC CGC TTT CAA-3′；IL-10：F-5′-CTG TCA TCG ATT TCT CCC TGT GAG-3′、R-5′-TGA GTG TCA CGT AGG CTT TCA TGC-3′；IL-1β：F-5′-CAA CCA ACA AGT GAT ATT CTC CAT G-3′、R-5′-GAT CCA CAC TCT CCA GCT GCA-3′；IL-17：F-5′-TCT GAG CCA GCC AAG AAG AAG TGT-3′、R-5′-TTC CAA CCC AAA CAT AGG CAC-3′；β-actin：F-5′-AGC TGT GCT ATG TTG CCC TAG ACT-3′、R-5′-ACC GCT CAT TGC CGA TAG TGA TGA-3′。

1.2.6Western blot检测 用RIPA裂解液抽提移植瘤组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度。用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后湿转至聚偏氟乙烯膜，5%脱脂牛奶封闭，加入一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜后二抗37℃孵育2 h，最后用电化学发光曝光显影，以GAPDH表达为内参。

1.2.7流式细胞仪检测移植瘤组织CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞含量 获取移植瘤组织，剪去结缔组织，RPMI1640培养基冲洗干净，眼科剪将移植瘤剪成1～2 mm3小块，置于含胶原酶的消化液中，于37℃培养箱消化1 h，后用100目筛网过滤去除未消化好的组织块，将得到的细胞悬液50 g离心1 min，以去除残留组织块。取上清移至新的离心管中，400 g离心10 min，用2 ml RPMI1640重悬细胞。取新离心管依次加入70% percoll和40%percoll各4 ml，沿管壁将细胞悬液缓慢加至分离液上面，2 000 r/min离心20 min，将位于70% percoll和40%percoll界面的淋巴细胞移至新离心管中，RPMI-1640洗涤细胞2次以去除残留淋巴细胞分离液。

调整细胞浓度至2×107ml-1，取5只流式管，分别记为空白、CD25同型对照、CD4CD25、Foxp3同型对照、CD4CD25Foxp3，于各管中分别加入100 μl细胞悬液。各管分别加入CD4、CD25抗体及同型对照，空白管不加任何抗体，CD25同型对照管加CD4抗体和CD25同型对照抗体，CD4CD25管加CD4抗体和CD25抗体，Foxp3同型对照管加CD4抗体和CD25抗体，CD4CD25Foxp3加CD4抗体和CD25抗体，混匀，4℃避光孵育30 min，混匀4℃避光孵育30 min，加2 ml染色缓冲液1 500 r/min离心5 min洗涤细胞2次，边涡旋边加冷固定/穿膜剂1 ml，4℃避光孵育30 min～18 h，加穿膜缓冲液2 ml，1 200 r/min×5 min离心洗涤2次，弃上清液。空白、CD25同型对照、CD4CD25管用300～400 μl染色缓冲液悬浮，混匀避光待测。Foxp3同型对照、CD4CD25Foxp3管中分别加入穿膜缓冲液稀释的Foxp3同型对照抗体或抗体，4℃避光孵育30 min，穿膜剂缓冲液2 ml，1 200 r/min离心5 min洗涤细胞2次，用300～400 μl染色缓冲液重悬后于流式细胞仪检测。

2 结果

2.1HIF-1α在缺氧肝移植瘤组织中的表达 本研究利用低氧探针标记缺氧组织，免疫组化检测肝移植瘤非缺氧组织和缺氧组织HIF-1α表达，经统计发现，缺氧组织中HIF-1α表达显著高于非缺氧组(1.09±0.23，3.44±0.45；t=14.704 7，P=0.000 0)，结果表明，HIF-1α在缺氧肝移植瘤组织中高表达(见图1)。

2.2缺氧肝移植瘤组织中免疫因子表达 最近研究表明，缺氧/HIF-1α信号能够抑制宿主抵御癌症[13,14]。为了证实这一观点，我们检测了肝移植瘤缺氧组织炎症和免疫因子的表达，结果如表1显示，与非缺氧组织相比，抗肿瘤因子IFN-γ、IL-12b和CXCL10表达水平显著降低(tIFN-γ=4.031 9，PIFN-γ=0.000 8；tIL-12b=4.889，PIL-12b=0.000 1；tCXCL10=2.212 9，PCXCL10=0.040 1)，相反，肿瘤促进因子IL-10、IL-1β和IL-17表达显著增加(tIL-10=2.931 6，PIL-10=0.008 9；tIL-1β=8.723，PIL-1β=0.000 0；tIL-17=3.650 7，PIL-17=0.001 8)。结果表明，肿瘤缺氧与免疫抑制有关，见图2。

2.3构建敲减HIF-1α的肝移植瘤 结果如图2所示，与Control组相比，敲减HIF-1α后肝癌细胞Hepa1-6小鼠移植瘤瘤重明显降低(1.47±0.12，0.48±0.03，t=25.309 8，P=0.000 0)，抑制了肿瘤生长。

2.4沉默HIF-1α的移植瘤中肿瘤浸润免疫细胞表达变化 流式细胞术检测沉默HIF-1α的移植瘤中肿瘤浸润免疫细胞CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞含量较Control组明显降低(13.80±2.43，2.97±1.15，t=12.739 1，P=0.000)，见图3。

图1 HIF-1α在缺氧与非缺氧肝移植瘤组织中的表达Fig.1 Expression of HIF-1α in hypoxic and non-hypoxic liver xenograftsNote: Compared with non-hypoxic group,*.P<0.05.

GroupsThe relative level of immune factorsIFN-γIL-12bCXCL10IL-10IL-1βIL-17Hon-hypoxic tissues group0.006 22±0.003 410.002 23±0.001 320.002 85±0.001 460.001 95±0.001 350.001 14±0.000 240.000 31±0.000 69Hypoxic tissues group0.001 82±0.000 531)0.000 15±0.000 261)0.001 74±0.000621)0.004 28±0.002 121)0.008 37±0.002 611)0.002 05±0.001 341)

Note：1)P<0.05 compared to non-hypoxic tissues group.

GroupsThe relative level of immune factorsIFN-γIL-12bCXCL10IL-10IL-1βIL-17Control group0.007 84±0.001 410.002 13±0.000 920.029 8±0.002 60.001 36±0.000 340.005 36±0.000 720.000 63±0.000 31shHIF-1α group0.013 97±0.001 451)0.004 46±0.001 021)0.052 4±0.013 21)0.004 65±0.002 121)0.009 61±0.003 011)0.001 34±0.000 261)

Note：1)P<0.05 compared to Control group.

图2 敲减HIF-1α抑制小鼠肝癌细胞移植瘤生长Fig.2 Knockdown of HIF-1α inhibited growth of mouse hepatoma cell xenograftsNote: A.The relative tumor weight;B.The expression of HIF-1α in the transplanted tumor was detected by Western blot;compared with Control group,*.P<0.05.

2.5沉默HIF-1α的移植瘤中免疫因子表达变化 移植瘤中免疫因子表达结果如表2所示，与Control组相比，敲减HIF-1α后移植瘤组织中抗肿瘤因子IFN-γ、IL-12b和CXCL10表达水平显著增加(tIFN-γ=9.584 4，PIFN-γ=0.000 0；tIL-12b=5.364 1，PIL-12b=0.000 0；tCXCL10=5.312 1，PCXCL10=0.000 0)，相反，肿瘤促进因子IL-10、IL-1β和IL-17表达显著降低(tIL-10=4.845 6，PIL-10=0.000 1；tIL-1β=4.342 5，PIL-1β=0.000 4；tIL-17=5.549 2，PIL-17=0.000 0)。由此可知，肿瘤组织中HIF-1α表达与免疫抑制有关。

3 讨论

肝癌是常见恶性肿瘤，其发病率居全世界恶性肿瘤第5位，死亡率高居第3位[15]，而在我国无论发病率还是死亡率均居恶性肿瘤第二位，且我国每年因肝癌死亡人数多达23万，约占全球肝癌死亡人数的55%，我国是一个肝癌大国[16,17]。由于肝癌早期无症状不明显，病情进展迅速，多数患者确诊时已处于中晚期失去治疗机会，仅有部分患者能够进行手术切除等根治性治疗，但这部分患者术后5年复发率高达60%～70%，预后极差[18,19]。因此，急需对肝癌恶化机制进行深入研究，寻找理想的治疗靶标。

缺氧是实体肿瘤的特征之一，缺氧微环境能够诱导肿瘤细胞中与増殖、分化、凋亡、能量代谢、血管形成、侵袭转移及放化疗耐受等相关癌基因表达，来维持癌细胞生长和转移等恶性表型[20,21]。HIF-1α是缺氧诱导的转录因子，能够影响多种原癌基因、肿瘤免疫因子的表达，如VEGF、IL-8、IL-6及TNF-α等，促进肿瘤的发生发展[7]。大量研究表明，HIF-1α在乳腺癌、胃癌及肝癌等肿瘤组织中异常高表达，且与患者淋巴结转移、肿瘤分期等预后指标相关[22-25]，HIF-1α在肝癌发生发展中具有重要作用。本研究通过构建肝移植瘤缺氧模型并利用缺氧探针进行标记，发现相较于非缺氧组织，缺氧组织中HIF-1α显著高表达，这与先前研究结论一致[7]。癌细胞逃避免疫应答的能力对于肿瘤恶性表型出现是至关重要的[26]。缺氧有助于肿瘤内的免疫抑制，帮助癌细胞逃避免疫攻击以及抑制免疫杀伤功能[27]。本研究发现，与非缺氧组织相比，缺氧组织中肿瘤抑制因子IFN-γ、IL-12b和CXCL10低表达，肿瘤促进因子IL-10、IL-1β和IL-17高表达。上述结果提示，缺氧诱导HIF-1α高表达可能与肿瘤免疫抑制有关。

图3 移植瘤组织中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞含量Fig.3 Content of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells in xenograft tumorsNote: Compared with Control group,*.P<0.05.

研究发现，免疫抑制细胞在肿瘤的低氧区积累，能够激活癌细胞免疫耐受机制使其逃避宿主免疫监视促进肿瘤进展，如调节性T细胞[13,28]。本研究构建了稳定敲减HIF-1α的Hepa1-6小鼠肝癌细胞移植瘤模型，敲减HIF-1α后肿瘤生长显著抑制，并且肿瘤浸润免疫抑制细胞CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞显著降低，肿瘤促进因子IL-10、IL-1β和IL-17表达也明显降低，相反肿瘤抑制因子IFN-γ、IL-12b和CXCL10表达显著增加。上述结果表明，沉默HIF1-α表达可逆转肝癌免疫抑制。本研究通过构建小鼠动物模型揭示了HIF1-α在肝癌免疫抑制中的作用，进一步揭示了缺氧诱导肿瘤免疫抑制的分子机制，为将来寻找诊治恶性肿瘤手段提供了一定实验基础。