线粒体凋亡途径在槲皮素诱导U937细胞凋亡中的作用研究①

朱玲玲 赵捷平 窦勤玲 张景利

(牡丹江医学院附属红旗医院血液科，牡丹江157011)

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia)是由造血干细胞恶变引起的恶性异质性疾病，其特征表现为造血系统中幼稚的肿瘤细胞通过增殖浸润进入血液、骨髓等组织，进而影响正常造血功能，为血液系统最常见的恶性肿瘤[1，2]。在过去十年中，我国急性髓系白血病死亡率男女分别居于第6 位和第8 位，处于世界中等水平，且有上升趋势，尚没有明确的预防和治疗措施，为卫生机构面临的巨大挑战之一[3]。随着对急性髓系白血病研究的深入，天然药物在预防和治疗急性髓系白血病中的作用日益受到重视[4]。槲皮素(Quercetin)又名栎精、槲皮黄素，属于黄酮类化合物，广泛存在于植物的花、叶和果实(如苹果、葡萄、洋葱、茶叶等)中，还存在于一些中药(如芦丁、三七、罗布麻、槐米等)中，具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗肿瘤和抗氧化等药理作用，尤其是近年来对其抗肿瘤作用的研究取得很大进展[5-7]。研究表明，槲皮素可诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人结肠癌HT-29细胞、小鼠膀胱癌MB49细胞等凋亡[8-10]。然而有关于槲皮素是否诱导人急性髓系白血病U937细胞凋亡及可能机制的研究少见报道，故本研究采用体外培养U937细胞，观察槲皮素对U937细胞凋亡的影响以及可能机制是否与线粒体凋亡途径有关。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株 人急性髓系白血病U937细胞株由中国科学院上海细胞库提供。

1.1.2主要试剂 槲皮素(纯度>98%)、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司，货号分别为Q4951-10G、D5879-100ML)；RPMI1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司，货号31800022、16000-044)；细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8，CCK-8)(天津百荧生物科技有限公司，批号35000)；AnnexinV-FITC/PI试剂盒(美国BD公司，货号BD-556547)；碘化丙啶(Propidiumiodide)(美国Axygen公司，货号xy-P4170)；3，3′-二己基含氧碳菁碘代物[3，3′-dihexyloxacarbocyanine iodide，DiOC6(3)](美国ENZO公司，货号ALX-610-046-M050)；兔抗人B细胞淋巴瘤因子-2(Human B cell lymphoma factor-2，Bcl-2)多克隆抗体、兔抗人Bcl-2相关X蛋白(Human Bcl-2-related X protein，Bax)多克隆抗体、兔抗人细胞色素c(Cytochrome c，Cyt c)多克隆抗体(美国Cell Signal公司提供，货号分别为2772S、2876S、11932S)；辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgGⅡ抗(美国Abbkine公司，货号A-08023)；增强化学发光(ECL)试剂盒(美国National Diagnostics公司，货号SGCL-300)；半胱氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-9(Cysteinyl aspartate specific proteinase-8，Caspase-9)活性测定试剂盒(德国Roche公司，货号分别为12012952001、112769 05001)。

1.1.3主要仪器 CO2培养箱(HERAcell 240i，美国Thermofisher Scientific公司)；低温高速离心机(GS-15R，美国BECKMAN公司)；酶标仪(RT-6100，美国Rayto公司)；BD流式细胞仪(FACScan，美国BD公司)；电泳仪(PowerPac HV，美国Bio-Rad公司)；转膜仪(VE-186，上海天能科技有限公司)；蛋白成像系统(ChemiDoc XRS，美国Bio-Rad公司)。

1.1.4细胞培养 复苏U937细胞，悬浮生长于含有10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养基(含青霉素100 U/ml和链霉素100 μg/ml)，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养。2～3 d传代1次，取对数期生长细胞用于后续实验。

1.1.5槲皮素配制 槲皮素溶解于DMSO(浓度<0.5%)配成160 μmol/L储备液，-20℃冰箱保存，临用时以RPMI1640培养液稀释到所需浓度。

1.2方法

1.2.1CCK-8检测U937细胞增殖 检测过程参照CCK-8检测试剂盒操作说明书进行。取对数生长期U937细胞，调整细胞密度为2×105个/ml，接种于96孔板，每孔100 μl。参照文献[11]及预实验结果，每孔分别加入浓度梯度为0(对照组，加入RPMI1640培养液100 μl)、10、20、40、80、160 μmol/L槲皮素100 μl。37℃、5%CO2及饱和湿度下分别培养24、48和72 h 后，每孔分别加入CCK-8 10 μl，继续培养3 h。RT-6100酶标仪于450 nm波长处测定吸光度值(OD)，计算增殖抑制率(Inhibitory rate)。Inhibitory ratio(%)=(1-OD给药组/OD空白对照组)×100%。每个剂量组设6个平行孔，取6孔平均值。

1.2.2流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染法检测U937细胞凋亡 参照CCK-8检测结果，取对数生长期U937细胞，调整细胞密度为2×105个/ml，接种于96孔板，每孔100 μl。随机分为：空白对照组(Control)：每孔加入RPMI1640培养液100 μl；槲皮素10 μmol/L组：每孔加入10 μmol/L 槲皮素100 μl；槲皮素20 μmol/L组：每孔加入20 μmol/L 槲皮素100 μl；槲皮素40 μmol/L组：每孔加入40 μmol/L槲皮素100 μl。各组U937细胞37℃、5%CO2及饱和湿度下继续培养48 h。1 200 r/min离心5 min，收集细胞，1 ml PBS冲洗2次，500 μl Binding Buffer重悬成单细胞悬液，依次加入Annexin V-FITC和Propidiumiodide液各5 μl混匀，室温避光反应15 min。1 h内以FACScan流式细胞仪检测U937细胞凋亡情况，计算总细胞凋亡率(Apoptosis rate)。Apoptosis rate(%)=右下象限的早期凋亡(Early apoptosis)细胞百分率+右上象限的晚期凋亡(Late apoptosis)细胞百分率。每个剂量组设6个平行孔，取6孔平均值。

1.2.3线粒体膜电位(Δψm)检测 分组及给药同1.2.2。1 200 r/min离心5 min，收集细胞，加入40 μmol/L DiOC6(3) 0.1 ml，37℃、5% CO2及饱和湿度下培养15 min，1 ml PBS冲洗2次。1 ml PBS重悬成单细胞悬液，FACScan流式细胞仪测定DiOC6(3)在细胞内荧光强度。以DiOC6(3)荧光强度间接反映出Δψm的高低。DiOC6(3)的激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。每个剂量组设6个平行孔，取6孔平均值。

1.2.4Western blot分析检测Bcl-2、Bax、Cyt c的表达 分组及给药同1.2.2。加入含有25 mmol/ml HEPES、1% Tris-HCl、50 mmol/ml NaCl、1 mmol/ml EDTA、1 mmol/ml EGTA、1 mmol/ml PMSF和1 μg/ml 亮肽素的冰冷的裂解缓冲液(pH=7.4)，10 000 r/min 4℃离心10 min，弃沉渣，收集上清液，BCA法测定总蛋白浓度。取50 μg蛋白上样后进行10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，湿转80 min后将蛋白转至0.45 μm PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h。分别与兔抗人Bcl-2多克隆抗体(1∶500稀释)，兔抗人Bax多克隆抗体(1∶500稀释)，兔抗人Cyt c多克隆抗体(1∶500稀释)4℃孵育过夜，1×TBS-T洗膜后加辣根过氧化酶标记山羊抗兔Ⅱ抗孵育2 h。以GAPDH(1∶500稀释)单克隆抗体重复上述实验过程，作为内参对照。ECL化学发光试剂显色。ChemiDoc XRS蛋白成像系统对各组条带进行计值及统计分析。每份样品检测6次，取平均值。

1.2.5Caspase-3、Caspase-9活性检测 分组及给药同1.2.2。严格按照Caspase-3、Caspase-9活性测定试剂盒说明进行检测，以RT-6100酶标仪测波长405 nm处的吸光度值(OD)表示活性变化。每份样品检测6次，取平均值。

2 结果

2.1槲皮素对U937细胞增殖的影响 CCK-8结果显示(图1)，U937细胞经浓度梯度0、10、20、40、80、160 μmol/L 槲皮素处理24、48和72 h后，槲皮素对U937细胞的增殖抑制率随着剂量的增加及作用时间的延长逐渐加强，既槲皮素呈时间-剂量依赖性地抑制U937细胞的增殖。槲皮素作用24、48和72 h的IC50分别为(143.9±12.6)，(51.4±4.2)和(30.1±2.7)μmol/L，故此后续实验采用≤40 μmol/L(即10、20、40 μmol/L)槲皮素及48 h作为实验浓度和处理时间。

2.2槲皮素对U937细胞凋亡的影响 流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染法检测结果显示(图2)，槲皮素10、20、40 μmol/L组U937细胞凋亡率显著升高，与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.3槲皮素对U937细胞Δψm的影响 经DiOC6(3)染色，采用流式细胞术检测DiOC6(3)荧光强度(M1部分)(图3)，DiOC6(3)染色阴性的细胞表现为弱的荧光强度(Hypofluorescence)，被认为是Δψm丢失的细胞，表示Δψm降低。结果显示，槲皮素10、20和40 μmol/L组弱荧光强度细胞百分率显著升高，与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，表明槲皮素可使Δψm丢失的细胞增多，从而降低Δψm。

图1 不同剂量槲皮素对U937细胞增殖的影响Fig.1 Effects of quercetin on proliferations of U937 cells

图2 槲皮素对U937细胞凋亡的影响Fig.2 Effects of quercetin on apoptosis of U937 cellsNote:Compared with control，*.P<0.01.

图3 槲皮素对U937细胞Δψm的影响Fig.3 Effects of quercetin on Δψm of U937 cellsNote:Compared with control，*.P<0.01.

图4 槲皮素对U937细胞Bcl-2、Bax和Cyt c表达的影响Fig.4 Effects of quercetin on expressions of Bcl-2，Bax and Cyt c of U937 cellsNote:Compared with control，*.P<0.01.

图5 槲皮素对U937细胞Caspase-3、Caspase-9活性的影响Fig.5 Effects of quercetin on activities of Caspase-3 and Caspase-9 of U937 cellsNote:Compared with control，*.P<0.01.

2.4槲皮素对U937细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Cyt c表达的影响 Western blot分析结果显示(图4)，槲皮素10、20、40 μmol/L组U937细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著下调，促凋亡蛋白Bax表达显著上调，Bcl-2/Bax比值显著下调，Cyt c表达显著上调，与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.5槲皮素对U937细胞Caspase-3、Caspase-9活性的影响 比色分析结果显示(图5)，槲皮素10、20、40 μmol/L组U937细胞Caspase-3、Caspase-9活性明显增高，与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

本研究发现，槲皮素对U937细胞增殖具有明显的抑制作用，且呈时间-剂量依赖性。以上结果提示，槲皮素可能对U937细胞生长具有抑制作用。

同时本研究也发现，槲皮素亦能诱导U937细胞凋亡，凋亡率显著升高。细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是指机体为了维持细胞内环境稳定，由一系列复杂的信号传导通路和基因调控的一种生理性死亡过程，对机体组织和器官的发育及防御致病因素具有十分重要作用。细胞凋亡途径根据启动过程主要包括线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径三种途径，而线粒体途径在介导细胞凋亡中承担着重要角色[12，13]。线粒体是凋亡信号转导途径中起关键调节作用的细胞器，在凋亡过程中具有重要的调控作用[14]。凋亡信号可通过激活多条上游通路而作用于线粒体。线粒体将凋亡信息整合后，发生形态或功能的改变，导致线粒体膜间隙的促凋亡因子(如Cyt c)释放。Δψm是反映线粒体内膜通透性的最佳指标之一，细胞是否正常与线粒体Δψm 有着密切关系，若Δψm下降则认为细胞必定凋亡至死[15，16]。Δψm的破坏被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一[17]。本研究发现，槲皮素可明显降低Δψm，提示槲皮素诱导U937细胞凋亡机制之一可能是通过线粒体介导的细胞凋亡途径实现的。为了进一步探讨槲皮素诱导U937细胞凋亡与线粒体凋亡途径的关系，本研究对Bcl-2、Bax、Cyt c表达及Caspase-3、Caspase-9活性进行了检测。

Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡的线粒体凋亡途径中起着非常重要的作用，其中Bcl-2和Bax分属Bcl-2家族中的抗凋亡和促凋亡两部分，通过维持抗凋亡、促凋亡成员的平衡来维持线粒体膜的完整性[18]。细胞凋亡是否发生由Bcl-2与Bax比值决定，Bcl-2/Bax比值是反映细胞生存能力的重要指标，即Bcl-2表达水平增加，Bcl-2/Bax异二聚体比例增加，抑制细胞凋亡；Bax蛋白水平增加时，Bcl-2/Bax比值下降，产生Bax/Bax同二聚体，细胞凋亡发生[19,20]。本研究发现，槲皮素显著下调U937细胞Bcl-2表达，上调Bax表达，下调Bcl-2/Bax比值。Cyt c是一种水溶性小分子物质，位于线粒体中，是线粒体呼吸链中传递电子的载体，而且是细胞凋亡调控的主要蛋白，也是最早被发现的线粒体释放的促凋亡蛋白[21,22]。半胱氨酸蛋白酶(Caspases)是一个在细胞凋亡中起关键作用的酶家族，是细胞凋亡的介导者和执行者，激活或超量表达均会引起细胞发生凋亡，又称凋亡蛋白酶，对凋亡起关键作用[23]。细胞的凋亡是由Caspase逐步发生级联反应引起的，而Caspase-9激活是线粒体通路激活的重要环节[24]。当Δψm降低后，线粒体膜肿胀、发生形态或功能的改变、通透性增高、导致Cyt c从内膜脱落出来并释放到胞浆中，能够使细胞Caspase-9前体自身催化形成有活性的Caspase-9，随后激活下游Caspase-3等效应Caspases分子，从而发生级联反应，最后诱导细胞凋亡[25,26]。本研究结果也发现，槲皮素显著上调U937细胞Cyt c表达，并升高Caspase-3和Caspase-9活性。综合以上结果提示，槲皮素诱导U937细胞凋亡的机制可能与线粒体凋亡途径激活有关。

综上所述，槲皮素可显著抑制U937细胞增殖，线粒体凋亡途径激活是槲皮素诱导U937细胞凋亡的途径之一。本研究局限之处在于尚未观察槲皮素对U937细胞Cyt c分布以及Caspase-3和Caspase-9表达的影响。有关于槲皮素对U937细胞Cyt c分布以及Caspase-3和Caspase-9表达的影响，本研究人员将会作进一步探讨。