shRNA干扰长链非编码RNA PVT1对甲状腺乳头状癌IHH-4细胞增殖、凋亡和周期的影响①

常 亮 袁红敏 赵立言 马明德

(河南大学淮河医院乳腺甲状腺外科，开封475000)

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，近20年来发病率呈逐年上升的趋势[1,2]。甲状腺癌分为甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)、甲状腺滤泡癌和甲状腺未分化癌3种类型[3]。其中，PTC占所有甲状腺癌发病的80%～90%[4]。经过手术、放化疗等治疗后，大多数PTC患者预后较好，但仍有近30%患者会出现淋巴转移，出现转移后生存率仅51%[5,6]。家族遗传、辐射和碘的异常摄入是诱导PTC的主要因素[7,8]。近年来研究表明，基因不稳定和基因异常表达在PTC发病过程中发挥了重要调控作用[9]。长链非编码RNA (Long non-coding RNA,LncRNA)PVT1(Plasmacytoma variant translocation 1)在多类癌细胞中呈高表达状态，在调控癌症发生发展过程中发挥重要作用[10,11]。但其对PTC细胞增殖、凋亡及周期的影响还较少见报道。本文以PTC细胞IHH-4为研究对象，探讨下调PVT1表达对PTC细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响，以期为临床PTC的治疗研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料 RPMI1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司。Trizol试剂购自美国Promega公司。逆转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒购自美国ThermoFhisher公司。CCK8试剂盒购自武汉默沙克生物技术公司。PI染色液和FITC-Annexin V购自美国BD公司。抗Ki67、Caspase-3和Cyclin A一抗购自英国Abcam公司。HRP标记山羊抗小鼠二抗购自北京博奥森生物科技公司。PVT1 shRNA由汉恒生物科技公司设计合成，慢病毒包装也由汉恒生物科技公司完成。PTC细胞株IHH-4购自中国科学院细胞库。

1.2方法

1.2.1细胞培养及转染 用含有10%胎牛血清的RMPI1640培养液将IHH-4细胞培养于37℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱中，待细胞融合率达到85%时进行传代培养。

转染前24 h将细胞以1×105传代培养于24孔板中。将细胞分为IHH-4组、sh-Ctrl组和sh-PVT1组，每组6个复孔。第2天 sh-PVT1组加入用完全培养液稀释的慢病毒稀释液构建PVT1低表达的IHH-4细胞，sh-Ctrl组加入不含目的基因的慢病毒，IHH-4组则加入正常培养液。转染24 h后更换为正常培养液，继续培养48 h后进行检测。

1.2.2动物分组及甲状腺乳头癌肿瘤移植模型复制 36只裸鼠由昆明中国科学院动物研究所提供，许可证号SCXK(滇)K2015-0003。将36只裸鼠随机分为IHH-4组、sh-Ctrl组和sh-PVT1组，分别取转染后的细胞，将细胞密度调整至2×107个/ml，于裸鼠右前背部皮下注射IHH-4细胞，连续饲养25 d，每天用游标卡尺测量肿瘤生长情况，计算肿瘤体积(肿瘤体积=长×宽×高/2)。

1.2.3取材 连续饲养裸鼠25 d后，腹腔注射过量10%水合氯醛处死裸鼠，并立即取出肿瘤，将肿瘤组织置于-20℃保存备用。

1.2.4RT-PCR检测PVT1的表达 用Trizol试剂提取各组细胞总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA，用实时定量PCR试剂盒检测PVT1表达量，以GAPDH为内参。所用到的引物序列如下：PVT1上游引物：5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3′，下游引物：5′-AGAGCACCAAGACTGGCTCT-3′；GAPDH上游引物：5′-GGGTGGAGCCAAACGGGTC-3′，下游引物：5′-GGAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3′。

1.2.5CCK8检测细胞增殖 用sh-PVT1转染细胞24 h后，将细胞传代培养于96孔板中，每组6个复孔，分别培养0、1、2、3和4 d后，小心吸去细胞上清液，每孔加入10 μl CCK8试剂，于培养箱继续孵育4 h 后，用酶标仪检测细胞吸光度，测定波长为450 nm。

1.2.6流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期 用胰酶消化后收集细胞，将细胞密度调整为1×106个/ml，用结合缓冲液清洗细胞，重悬沉淀后加入FITC-Annexin V和 PI溶液，室温避光孵育15 min 后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

用胰酶消化后收集各组细胞，PBS清洗后，加入乙醇溶液于4℃固定30 min。30 min后加入预冷的PBS清洗细胞，加入PI溶液室温避光染色30 min，最后用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.2.7Western blot检测蛋白表达 用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA试剂盒检测细胞总蛋白浓度。每组取等量蛋白质用10%SDS-PAGE分离蛋白，转移蛋白至PVDF膜，TBST清洗3次后，5% 脱脂牛奶室温封闭2 h。封闭完成后加入适宜浓度一抗(Ki67,1∶1 200;Caspase-3,1∶1 000;Cyclin A,1∶1 000)于4℃封闭过夜，第2天小心吸走一抗，清洗PVDF膜后，加入相应二抗室温封闭1 h，滴加ECL显色液，用凝胶成像系统获取蛋白条带图片，用Image J对蛋白质表达量进行定量分析，以GAPDH为内参。

2 结果

2.1sh-PVT1对IHH-4细胞PVT1表达的影响 与sh-Ctrl组比较，sh-PVT1组IHH-4细胞PVT1表达水平明显降低(P<0.01，图1)，差异有统计学意义，提示转染成功。

2.2sh-PVT1对IHH-4细胞增殖的影响 如图2所示，sh-PVT1转染细胞后4 d，与sh-Ctrl组比较，sh-PVT1组细胞增殖倍数显著降低(P<0.05，图2)；同时，sh-PVT1组IHH-4细胞Ki67蛋白表达水平明显低于sh-Ctrl组(P<0.01，图3)，表明沉默PVT1能抑制IHH-4细胞增殖。

2.3sh-PVT1对IHH-4细胞凋亡的影响 流式细胞术实验结果表明，sh-PVT1组IHH-4细胞凋亡率与sh-Ctrl组比较明显升高(P<0.01，图4)；同时，sh-PVT1还能诱导细胞凋亡标志蛋白Caspase-3表达(P<0.01，图3)，表明沉默PVT1能诱导甲状腺乳头状癌细胞凋亡。

2.4sh-PVT1对IHH-4细胞周期的影响 与sh-Ctrl组比较，sh-PVT1组G2/M期细胞比例明显增多，G0/G1期细胞比例有所减少，S期变化不明显，表明sh-PVT1可显著诱导IHH-4细胞G2/M期阻滞(P<0.05，图5)；同时sh-PVT1还能显著抑制周期蛋白Cyclin A的表达(P<0.01，图3)，提示沉默PVT1可诱导甲状腺乳头状癌细胞发生细胞周期阻滞。

图1 sh-PVT1对IHH-4细胞PVT1表达的影响Fig.1 Effect of sh-PVT1 on expression of PVT1 in IHH-4 cells Note: n=6,vs sh-Ctrl group，**.P<0.01.

图2 sh-PVT1对IHH-4细胞增殖的影响Fig.2 Effect of sh-PVT1 on cell proliferation of IHH-4 cells Note: n=6,vs sh-Ctrl group，*.P<0.05.

2.5sh-PVT1对肿瘤生长的影响 与IHH-4组比较，sh-Ctrl组裸鼠肿瘤大小无明显变化；与sh-Ctrl组比较，sh-PVT1组裸鼠肿瘤组织体积显著减小(P<0.01，图6)，表明干扰PVT1表达能抑制甲状腺乳头瘤的生长。

2.6sh-PVT1对肿瘤组织蛋白表达的影响 Western blot实验结果表明，sh-PVT1能显著抑制甲状腺乳头瘤模型裸鼠肿瘤组织细胞增殖相关蛋白Ki67和细胞周期相关蛋白Cyclin A表达(P<0.01，图7)，还可明显上调肿瘤组织细胞凋亡相关蛋白Caspase-3的表达水平(P<0.01，图7)，提示sh-PVT1能抑制肿瘤组织细胞增殖，诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。

图3 sh-PVT1对Ki67、Caspase-3和Cyclin A蛋白表达的影响Fig.3 Effects of sh-PVT1 on expressions of Ki67,Caspase-3 and Cyclin ANote: GAPDH was used as loading control.n=6,vs sh-Ctrl group，**.P<0.01.

图4 sh-PVT1对IHH-4细胞凋亡的影响Fig.4 Effect of sh-PVT1 on cell apoptosis of IHH-4 cellsNote: n=6,vs sh-Ctrl group，**.P<0.01.

图5 sh-PVT1对IHH-4细胞周期的影响Fig.5 Effect of sh-PVT1 on cell cycle of IHH-4 cellsNote: n=6,vs sh-Ctrl group，*.P<0.05.

图6 sh-PVT1对肿瘤生长的影响Fig.6 Effect of sh-PVT1 on tumor growthNote: n=6,vs sh-Ctrl group，**.P<0.01.

图7 sh-PVT1对肿瘤组织Ki67、Caspase-3和Cyclin A表达的影响Fig.7 Effects of sh-PVT1 on expressions of Ki67,Caspase-3 and Cyclin ANote: n=6,vs sh-Ctrl group，**.P<0.01.

3 讨论

近年来大量研究表明，LncRNA在细胞生长和人类的疾病发展过程中发挥重要的调控作用[12]。LncRNA的异常表达与癌症的发生发展具有密切关系[13,14]。研究发现，LncRNA PVT1在正常细胞和组织中表达较少，但在胃癌、肝癌、宫颈癌及黑色素瘤等多种癌细胞中呈高表达状态，并可作为诊断癌症恶化的指标[11,15-17]。也有研究表明，PVT1在IHH-4、FTC-133和8505C三类甲状腺癌细胞系中表达水平明显升高[18]。本文研究也发现PVT1在IHH-4细胞中呈高表达状态，表明PVT1可能与甲状腺癌的发生发展密切相关。

调控癌细胞增殖是影响癌症发展的关键。研究表明，PVT1在肺癌细胞的高表达与肺细胞的异常增殖有关，抑制PVT1表达能明显抑制肺癌细胞增殖[19]。Iden等[10]研究发现，PVT1在121例出现癌症转移的宫颈癌患者癌组织中均呈高表达状态，表明PVT1与宫颈癌患者的预后密切相关。在本研究中，我们采用RNA干扰技术，设计合成sh-PVT1，用慢病毒将sh-PVT1转染入IHH-4细胞，采用RT-PCR检测PVT1的表达水平，发现sh-PVT1转染细胞后，IHH-4细胞PVT1表达水平显著降低，表明转染成功。sh-PVT1转染细胞后4 d，IHH-4细胞增殖倍数和肿瘤生长速度显著降低，同时sh-PVT1还能明显抑制IHH-4细胞和肿瘤组织细胞增殖标志蛋白Ki67的表达，表明抑制PVT1表达能抑制IHH-4细胞增殖。

研究表明，PVT1的促癌作用还与其抑制癌细胞凋亡有关。Wu等[20]研究发现，PVT1可通过下调Bcl-2家族蛋白Mcl-1的表达抑制肾癌细胞凋亡，还可通过上调凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达抑制前列腺癌肿瘤的生长[21]。卵巢癌细胞对顺铂化疗抵抗性的形成与PVT1调控卵巢癌细胞凋亡有关[22]。但PVT1对甲状腺癌细胞凋亡的作用还未见报道。本研究发现，沉默PVT1可显著降低IHH-4细胞凋亡率，同时还能降低癌细胞和肿瘤组织Caspase-3的蛋白表达水平，表明下调PVT1表达能通过抑制Caspase-3的表达诱导PTC细胞凋亡。

细胞周期阻滞是导致细胞增殖抑制、细胞凋亡的主要原因之一。研究表明，LncRNA可参与癌细胞周期的调控。Marza等[23]研究发现，下调LncRNA GAS5表达可通过激活BRCA1和p53诱导成神经细胞瘤细胞周期阻滞，从而诱导癌细胞凋亡。沉默LncRNA Linc0015能诱导多种胃癌细胞系发生G1期阻滞，抑制癌细胞凋亡和转移[24]。也有研究表明，PVT1可通过靶向调控miR-26b表达抑制黑色素瘤细胞发生G0/G1期细胞周期阻滞[25]。本文研究结果表明，沉默PVT1表达能显著增加IHH-4细胞G2/M期的细胞比例，减少处于G0/G1期的细胞比例，对细胞S期无明显影响，表明sh-PVT1能诱导甲状腺乳头状细胞发生G2/M期阻滞。Cyclin A是一类真核细胞周期调控蛋白，主要参与G1-S期和G2/M期细胞周期调控[26,27]。研究表明，Cyclin A在甲状腺乳头状癌细胞中表达异常增多，表明Cyclin A可能通过调控细胞周期影响甲状腺癌的发展[28]。但PVT1是否能通过调控Cyclin A的表达影响IHH-4细胞周期分布还未知。本文研究表明，sh-PVT1能显著下调IHH-4细胞和肿瘤组织Cyclin A的蛋白表达水平，提示敲除PVT1可能通过抑制Cyclin A的表达诱导IHH-4细胞G2/M期周期阻滞。

综上所述，sh-PVT1能降低IHH-4细胞增殖倍数、抑制肿瘤生长、升高癌细胞凋亡率和细胞周期G2/M期细胞比例，并且还能抑制细胞增殖标志蛋白Ki67和周期蛋白Cyclin A的表达，上调Caspase-3表达水平，表明敲除PVT1能抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖，并能诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，从而发挥抗PTC的作用。本研究初步探究了shRNA干扰PVT1对甲状腺乳头状癌的作用，后期将进一步探究具体作用机制。