大叶秦艽花环烯醚萜类成分对胶原诱导性关节炎小鼠的治疗作用及相关机制探讨①

贾 娜 崔 佳 赵 超 李锐莉 文爱东

(空军军医大学西京医院药剂科，西安710032)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为特征性改变的慢性自身免疫疾病，引起关节内骨、软骨、甚至关节内韧带和肌腱的细胞外基质进行性和不可逆性破坏，导致关节畸形、强直和功能丧失，甚至残废[1]。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)是细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)降解及重构的重要介质，能够导致软骨、韧带及骨破坏[2]。秦艽始载于《神农本草经》，可祛风湿，舒经络，清虚热，利湿退黄，用于风湿疾病治疗己有近两千年历史。环烯醚萜(Iridoids)是从龙胆科植物大叶秦艽的花中提取得到的单萜化合物，具有多种药理作用，是秦艽的特征性成分和主要活性成分[3]。课题组之前的研表明，大叶秦艽花具有显著的抗炎镇痛活性[4]。本实验在前期研究的基础上，拟采用CIA小鼠模型进一步考察大叶秦艽花环烯醚萜类成分(GMI)是否具有抗类风湿关节炎活性，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂 动物：健康清洁级雄性C57BL/6J小鼠，10～14周龄，第四军医大学试验动物中心提供。分笼饲养，室温20～25℃，湿度40%～60%，自由摄食饮水。本研究所涉及的动物相关操作均在西京医院伦理委员会的批准下进行(批准号：XJYYLL-2014302)。

药物与试剂：大叶秦艽花于2013年采自陕西陇县，经西北大学胡正海教授鉴定为大叶秦艽(Gentiana macrophylla Pall.)的花，样品存放于西北大学陕西省生物医药重点实验室；环烯醚萜类化合物(GMI)由空军军医大学西京医院药剂科新药研发中心制备，纯度65.2%；地塞米松片购自浙江仙琚制药股份有限公司；鸡Ⅱ型胶原购自美国Sigma公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自美国Chondrex公司；MMP1和MMP3多克隆抗体购自美国Proteintech公司；匀浆器为德国IKA公司产品。

1.2方法

1.2.1CIA模型的建立 鸡CⅡ溶解于0.1 mol/L冰醋酸中，浓度为4 mg/ml，放置于4℃过夜。将溶解的胶原与弗氏完全佐剂等体积混合，冰浴中使用匀浆器充分乳化。免疫动物时，在小鼠尾根部多点皮内注射0.1 ml乳剂。基础免疫后第14天，以同样的方法等体积混合胶原与弗氏不完全佐剂，避开初次免疫部位，进行加强免疫。同时，对照组等体积注射生理盐水[5]。

从加强免疫后(实验第14天)开始观察并记录关节炎指数(AI)，1次/7 d。采用5级评分法：无红肿为0分；小趾关节红肿为1分；趾关节和足跖肿胀为2分；踝关节以下足爪肿胀为3分；含踝关节在内的全部足爪肿胀为4分。计算继发侧足爪评分之和，即为每只大鼠的AI。评分2分以上为成功模型。

1.2.2分组 将实验小鼠随机分为5组，每组10只，分别为正常组、CIA模型组、地塞米松(DEX)组(0.25 mg/kg)、GMI组(30 mg/kg)和GMI组(15 mg/kg)。各组动物灌胃给药，1次/d，连续28 d，末次给药1 h后进行手术。正常组和CIA组每次注射等量生理盐水，其余实验步骤与GMI给药组相同。实验结束后，小鼠腹腔注射戊巴比妥钠处死(65 mg/kg)。

1.2.3滑膜组织病理学检测 采用苏木素-伊红(HE)染色法进行检测。取各组小鼠右后踝关节，4%多聚甲醛固定，10%EDTA 脱钙，常规脱水，石蜡包埋，切片，HE 常规染色，光镜下观察踝关节滑膜组织形态学病理改变。

1.2.4ELISA测定血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平 采用ELISA法进行测定。腹主动脉取血，3 000 r/min离心15 min，取上清，备用，按照ELISA试剂盒操作说明测定TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长测光密度(OD值)，绘制标准曲线，计算浓度。

1.2.5蛋白质免疫印迹(Western blot)滑膜组织中MMP1和MMP3的含量 采用Western blot法进行测定。将取好的踝关节滑膜组织置于匀浆器，冰上研磨提取组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；SDS-PAGE电泳，5%的浓缩胶80 V，30 min，15%的分离胶120 V，45 min；150 A转膜2 h；脱脂奶粉封闭 2 h；加入一抗(MMP1、MMP3和β-actin，1∶1 000)过夜放置于4℃过夜；用TBST溶液洗膜15 min，3次；二抗(1∶1 200)于室温孵育2 h；TBST溶液洗膜15 min，3次；加入显影液配制1 ml(1∶1)，放入化学发光仪检测；采用Quantity One 软件对显影出的条带进行分析，计算分析MMP1、MMP3和β-actin 条带的灰度比值。

2 结果

2.1GMI对AI值的影响 与CIA模型比较，给予地塞米松能抑制AI值的增加，GMI组(30 mg/kg)和GMI组(15 mg/kg)均可显著降低AI值，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2GMI对小鼠踝关节滑膜组织病理学的影响 在光学显微镜下观察，正常组的踝关节滑膜组织排列整齐，未见充血、水肿、炎细胞浸润等的炎性现象，滑膜细胞增生及血管翳形成不可见；与正常组比较，CIA模型组滑膜组织细胞排列密集且凌乱，滑膜组织细胞数量较多，出现充血及大量炎性细胞，可观察到淋巴细胞；与模型组比较，地塞米松组及GMI(30 mg/kg)组滑膜组织充血及炎细胞数量明显减少，GMI(15 mg/kg)组滑膜组织病理变化不明显。见图2。

图1 GMI对AI值的作用Fig.1 Effects of GMI on arthritis scoresNote: Compared with CIA group，*.P<0.05.

图2 GMI对小鼠踝关节滑膜组织病理变化的影响(HE，×40)Fig.2 Effects of GMI on histopathological changes in joints of CIA mice(HE，×40)Note: A.Normal group；B and C.CIA group；D.Dex group；E.GMI(30 mg/kg)group；F.GMI(15 mg/kg)group.

图3 GMI对小鼠血清中TNF-α(A)、IL-1β(B)和IL-6(C)含量的影响Fig.3 Effects of GMI on TNF-α(A),IL-1β(B)和IL-6(C)Note: Compared with normal group,#.P<0.05；compared with CIA group，*.P<0.05.

2.3GMI对小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影响 与正常组比较，模型组小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)； 与模型组比较， 地塞米松组、GMI组(30 mg/kg)和GMI组(15 mg/kg)能够显著抑制血清TNF-α，IL-1β和IL-6的含量，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3A～C。

2.4GMI对滑膜组织中MMP1和MMP3含量的影响 与正常组相比， CIA模型组小鼠滑膜组织中MMP1和MMP3的蛋白表达明显增高；而地塞米松组、GMI组(30 mg/kg)和GMI组(15 mg/kg)蛋白水平较CIA组显著降低(P<0.05)。提示GMI能够抑制CIA小鼠滑膜组织中MMP1和MMP3表达的增高。见图4。

3 讨论

RA最终表现为不可逆的关节侵蚀和软骨破坏。成纤维样滑膜细胞紧邻滑膜下层，靠近软骨，在类风湿滑膜炎症、血管翳形成和滑膜增生等RA关键病理环节中占据主导地位[6]。MMPs是细胞外基质降解及重构的重要介质。在RA血管翳与软骨交界处及关节其他部位均发现多种MMPs的过量表达。MMPs能够引起胞外基质的降解以及最终导致软骨、韧带及骨破坏。MMPs对RA关节的破坏作用至少包括两条途径：首先为直接降解软骨和骨质；其次，MMPs在血管再生方面具有重要的作用，而血管翳是RA的突出特征，血管生成时，微血管基底膜和间质成分被降解。MMPs在RA关节损伤过程中起着重要作用，可作为反映病情活动指标和监测软骨破坏程度指标。已有临床研究表明，抑制RA患者MMP-2、3、9的表达，可以有效保护RA患者的骨关节破坏[7]。因此MMPs是RA治疗的重要靶点。关节的滑膜组织增生、纤维素渗出、成纤维细胞和炎细胞浸润、血管翳形成，以及骨和软骨进行性不可逆的破坏，都与细胞因子失调有关。TNF-α可促进滑膜细胞产生主要致炎细胞因子IL-1、IL-6等[8]。

RA发病以青壮年为多，致残率高达60%～70%，严重威胁人类的生命健康。现行临床上针对RA的治疗策略主要有：一是在起始期使用非甾体类抗炎药物进行保守控制，但这并不能阻止RA病变的自然过程；二是当明显的侵蚀状态显现出来时使用抗风湿药物，例如金制剂、青霉胺、免疫抑制剂(氨甲蝶呤)等，但会出现血小板减少、尿蛋白、过敏性皮疹等副作用；三是激素疗法，首选的肾上腺皮质激素对关节肿痛作用迅速，但效果不持久，并且长期应用可导致物质代谢和水盐代谢紊乱，骨质疏松等严重不良反应。另外目前一些针对免疫细胞和细胞因子的生物制剂日渐用于RA的治疗，但对于RA后期患者仍疗效欠佳，并且半衰期短，还可导致严重心血管不良反应[9]。因此开发一种副作用小且作用持久的RA 治疗药物是亟待解决的难题。

本实验研究结果表明，GMI能显著降低CIA小鼠的AI，有效改善CIA小鼠的组织病理学改变，显著抑制血清中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，降低关节滑膜组织中MMP1和MMP3的表达水平，且呈一定的剂量依赖性。提示GMI对RA疾病的发生发展过程具有一定的治疗作用，其药理作用可能通过降低血清中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，并进一步抑制MMP1和MMP3的表达水平，从而减轻软骨损伤，发挥抗RA的疗效。本实验为将GMI开发成为疗效确切、安全经济的RA临床治疗药物提供理论基础。