当归与糖皮质激素治疗哮喘对HMGB1表达及阴虚症状的影响①

程小丽 段海婧 王志旺 付晓艳 姚 楠 刘雪枫 王瑞琼

(甘肃中医药大学,兰州730000)

《神农本草经》谓当归“主咳逆上气”，《本草蒙筌》言其“血药补阴”、对阴虚“咳逆上气”有“补血养阴、和血降气”之功，如临床上当归配伍用于治疗阴虚证支气管哮喘[1]。另一方面，糖皮质激素是目前治疗哮喘、特别是重症哮喘的常用药，但用药早期可引起阴虚症状[2]。本实验拟将当归与氢化可的松合用治疗哮喘小鼠模型，通过考察平喘指标与阴虚指标，探讨当归与糖皮质激素在治疗哮喘中的增效(平喘)减副(阴虚)作用；同时，从高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的角度探讨当归与糖皮质激素平喘的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药品与试剂 当归(RASI)，采于甘肃省岷县，经杨扶德教授鉴定为Radix Angelicae Sinensis的干燥根，加工成饮片后用水煎煮，取滤液适当浓缩后冷藏备用；注射用氢化可的松琥珀酸钠(Hydrocortisone sodium succinate,HSS)天津生物化学制药有限公司生产，国药准字H12020493，批号：011606014；卵蛋白(OVA)，批号：SLBQ8172V、Sigma公司生产；氢氧化铝，批号：20161003,天津市致远化学试剂有限公司生产；TNF-α、IL-1β及IL-6试剂盒，批号：20170404、20170501、20170403南京建成生物工程研究所生产，HMGB1 Polyclonal antibody，批号：B0201,美国Immuno Way公司生产。

1.1.2仪器 CH Technologies的鼻部暴露/全身暴露吸入染毒系统；江苏鱼跃医疗设备股份有限公司的402AI型超声雾化器；北京广源达科技发展有限公司的EMKA型动物肺功能检测系统；成都泰盟科技有限公司的ZZ-6型小鼠自主活动测试仪。

1.1.3动物 SPF级BALB/c小鼠，雌雄各半，体重16～19 g，由甘肃中医药大学科研实验动物中心提供并进行实验，许可证号：SCXK(甘)2011-0001。

1.2方法

1.2.1分组、造模并给药 将小鼠随机分为6组，即空白对照组(Blank control)、阴虚模型组(Yin deficiency,采用0.05 g/kg氢化可的松造模)、哮喘模型组(Asthma)、氢化可的松组(HSS,采用0.05 g/kg氢化可的松治疗)、当归组(RASI,8 g/kg当归)、合用组(RASI+HSS,8 g/kg当归与0.05 g/kg氢化可的松合用)，每组12只。根据文献[3]复制哮喘模型，实验第1、8天每只小鼠腹腔注射OVA致敏液0.2 ml(内含100 μg OVA和2 mg氢氧化铝的生理盐水混悬液)，同时背部皮下注射等量致敏液，空白对照组与阴虚模型组以生理盐水代替致敏。第15天开始激发，让小鼠吸入1% OVA激发液20 min，1次/d，连续7 d，空白对照组与阴虚模型组以生理盐水代替。从激发开始在激发前1 h灌胃下述药物：当归组与合用组小鼠每天给予上述剂量当归，阴虚模型组、氢化可的松组及合用组从激发第3天开始每天给予上述剂量氢化可的松。

1.2.2一般情况 实验过程中检测动物体重，第20天测定小鼠24 h内的进食与饮水量；实验第21天晚上8点测定小鼠自主活动，开启自主活动仪，将小鼠放入并适应3 min后，测定5 min的活动次数与站立(抬头)次数。

1.2.3哮喘行为学 实验第20天，按上述激发方法让小鼠吸入2%OVA激发液120 s，观察10 min内小鼠抓鼻次数、挠痒次数、哮喘发作及其症状，对哮喘行为学进行半定量分析[4]。

1.2.4肺功能 实验第22天测定肺功能，调试肺功能仪，将小鼠放入封闭系统中，启动系统，等小鼠安静后记录呼吸频率、潮气量等肺功能指标。

1.2.5采集标本、测定指标 实验第22天，小鼠经戊巴比妥麻醉后处死，手术暴露气管，结扎左支气管，提取支气管肺泡灌洗液(BALF)，离心后取其上清液按试剂盒说明书测定TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。摘取肺脏，取左肺组织，分别进行HE染色与免疫组化染色，观测肺组织炎性细胞浸润程度[5]与HMGB1表达水平并进行半定量分析。

2 结果

2.1当归与氢化可的松及其合用对哮喘小鼠进食及饮水量的影响 实验第20天时，阴虚模型组、氢化可的松组小鼠的进食量与饮水量明显增加，与空白对照组、哮喘模型组比较分别具有统计学意义(P<0.01)；合用组小鼠的进食量与饮水量下降，与氢化可的松组比较有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2当归与氢化可的松及其合用对哮喘小鼠体重的影响 致敏和激发前，各组小鼠体重没有差异，实验第22天阴虚模型组、氢化可的松组小鼠的体重明显下降，分别与空白对照组、哮喘模型组比较有统计学意义(P<0.01)；在当归的干预下，合用组小鼠的体重明显增加，与氢化可的松组比较有统计学意义(P<0.05)，见表2。

GroupsDose(g/kg)Foodintake(g/d)Waterintake(ml/d)Blank control-3.32±1.365.79±0.85Yin deficiency-5.37±1.591)7.80±1.101)Asthma-3.38±1.375.87±0.84HSS0.055.32±1.602)7.88±1.112)RASI83.50±1.205.51±0.86HSS+RASI0.05+83.82±1.333)6.59±1.053)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate;vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.01;vs HSS,3)P<0.05.

2.3当归与氢化可的松及其合用对哮喘小鼠自主活动的影响 阴虚模型组、氢化可的松组小鼠的站立(抬头)次数、活动次数明显增加，分别与空白对照组、哮喘模型组比较有统计学意义(P<0.05,0.01)；合用组小鼠的站立次数与活动次数明显减少，与氢化可的松组比较有统计学意义(P<0.01)，见表3。

2.4当归与氢化可的松及其合用对小鼠哮喘行为学的影响 在OVA激发下，哮喘模型组哮喘发作的小鼠增多，哮喘行为学评分增加，与空白对照组比较有统计学意义(P<0.01)；在当归、氢化可的松及其合用的干预下，小鼠上述哮喘指标得到明显缓解，与哮喘模型组比较有统计学意义(P<0.05,0.01)。合用组的作用有进一步增强的趋势，但与当归组、氢化可的松组比较没有统计学意义，见表4。

2.5当归与氢化可的松及其合用对哮喘小鼠肺功能的影响 哮喘模型组小鼠呼吸频率(Frequence,F)显著增加，潮气量(TV)显著下降，与空白对照组比较有统计学意义(P<0.01)。在当归、氢化可的松及其合用的干预下，F明显下降，TV明显增加，与哮喘模型组比较有统计学意义；合用组TV增加更明显，与当归组相比有统计学意义(P<0.05,0.01)，见表5。

GroupsDose(g/kg)Body weight(g)First dayFourteenth dayTwenty-second dayBlank control-25.7±2.130.3±4.232.4±3.8Yin deficiency-25.3±1.730.3±3.228.1±2.21)Asthma-25.4±2.531.1±3.332.2±3.0HSS0.0525.2±1.529.2±3.228.4±2.42)RASI825.1±1.829.6±3.931.4±3.7HSS+RASI0.05+825.1±2.330.5±3.730.3±2.83)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate.Vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.01;vs HSS,3)P<0.05.

GroupsDose(g/kg)Standing timesper 5 minActivity timesper 5 minBlank control-36.3±14.13.3±1.9Yin deficiency-67.8±19.61)7.2±2.41)Asthma-49.1±18.14.8±2.0HSS0.0569.0±17.22)6.8±2.32)RASI847.3±19.24.5±1.5HSS+RASI0.05+845.8±15.33)4.2±1.93)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate.Vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.05;vs HSS,3)P<0.01.

2.6当归与氢化可的松及其合用对哮喘小鼠肺组织病理学的影响 空白对照组小鼠肺组织镜下病理变化不明显(图1A)；哮喘模型组小鼠肺组织出现明显的病理变化，支气管壁充血、结构紊乱，上皮细胞肿胀，基底膜增厚、边缘模糊(图1C)。在氢化可的松、当归及其合用干预下，上述肺组织病理变化得到一定的缓解(图1D～F)。对支气管壁及其周围组织炎性细胞浸润程度进行半定量分析，结果显示，氢化可的松组、 当归组及合用组支气管炎性细胞浸润程度出现缓解，与哮喘模型组比较有统计学意义(P<0.05、0.01)，见图1、表6。

GroupsDose(g/kg)nAsthmaattackAsthmaticbehaviors scoreBlank control-1213.58±1.51Yin deficiency-1203.50±1.88Asthma-12101)7.50±2.471)HSS0.051212)3.17±1.192)RASI81233)3.67±2.062)HSS+RASI0.05+81202)2.25±1.602)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate.Vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.01,3)P<0.05.

GroupsDose(g/kg)F(bpm)TV(ml)Blank control-122.9±13.90.117±0.018Yin deficiency-127.3±14.60.115±0.016Asthma-173.4±25.41)0.084±0.0111)HSS0.05140.6±19.32)0.105±0.0152)RASI8152.5±22.23)0.096±0.0133) 4)HSS+RASI0.05+8137.2±16.32)0.112±0.0162)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate.Vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.01;3)P<0.05；vs HSS+RASI,4)P<0.05.

2.7当归与氢化可的松及其合用对哮喘小鼠BALF中细胞因子的影响 哮喘模型组小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6显著升高，与空白对照组比较有统计学意义(P<0.01)。经当归、氢化可的松及其合用干预后，TNF-α、IL-1β和IL-6明显下降，与哮喘模型组比较有统计学意义(P<0.01)；合用组比当归组、氢化可的松组降幅更大，部分指标有统计学意义(P<0.05、0.01)，见表7。

2.8当归与氢化可的松及其合用对哮喘小鼠肺组织HMGB1表达的影响 如图2所示，HMGB1主要表达于气道上皮细胞和炎症细胞的细胞核与细胞质中，呈棕黄色。空白对照组小鼠HMGB1呈弱阳性表达，而在哮喘模型组中表达明显增强；在当归、氢化可的松及其合用的干预下，HMGB1的表达有一定的减弱趋势。对HMGB1表达进行半定量分析，结果显示，哮喘模型组HMGB1表达的平均光密度值明显升高，与空白对照组比较有统计学意义(P<0.01)； 在当归、氢化可的松及其合用的干预下，HMGB1表达的平均光密度值下降，其中合用组与哮喘模型组比较有统计学意义(P<0.05)，见图2、表8。

图1 当归与氢化可的松及其合用对哮喘小鼠肺组织病理学的影响(HE染色,×10)Fig.1 Effects of RASI,HSS and their combination on lung histopathology in asthmatic mice(HE stain-ing,×10)Note: A.Blank control group;B.Yin deficiency model group;C.Asthma model group;D.HSS group;E.RASI group;F.RASI and HSS group.

GroupsDose(g/kg)nInf.cell infiltration in bronchus-(0)+(1)++(2)+++(3)Mean seriesValue of R(95% Confidence interval)Blank control-1284000.330.19±0.17Yin deficiency-1293000.250.12±0.17Asthma-1200572.580.80±0.171)HSS0.051206601.500.47±0.172)RASI81205611.670.52±0.172)HSS+RASI0.05+81207501.420.44±0.173)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate.Vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.05,3)P<0.01.

GroupsDose(g/kg)TNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)Blank control-231.93±34.94205.73±28.82144.43±29.11Yin deficiency237.85±36.42211.48±27.71149.20±31.58Asthma-349.74±49.551)439.28±45.481)392.37±46.351)HSS0.05276.31±40.812)288.69±34.442)250.51±36.262)3)RASI8291.79±41.102)3)358.06±37.482)4)304.83±39.862)4)HSS+RASI0.05+8258.21±36.642)261.68±30.992)211.23±34.272)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate.Vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.01;vs HSS+RASI,3)P<0.05,4)P<0.01.

图2 当归与氢化可的松及其合用对哮喘小鼠肺组织HMGB1表达的影响(×40)Fig.2 Effects of RASI,HSS and their combination on expression of HMGB1 in asthmatic mice(×40)Note: A.Blank control group;B.Yin deficiency model group;C.Asthma model group;D.HSS group;E.RASI group;F.RASI and HSS group.

GroupsDose(g/kg)nHMGB1Blank control-120.212±0.009Yin deficiency-120.210±0.007Asthma-120.256±0.0161)HSS0.05120.245±0.013RASI8120.249±0.014HSS+RASI0.05+8120.241±0.0132)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate.Vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.05.

3 讨论

当归是临床常用中药，素有“十方九归”之说，《神农本草经》开篇就说当归“主咳逆上气”，即当归可用于治疗支气管哮喘等呼吸系统疾病，临床上当归与其他中药配伍成复方，如《和剂局方》中的苏子降气汤、《慎斋医书》中的百合固金汤和《医学入门》中的加味益母丸，发挥补血养阴润肺、活血通脉降气等功效。药理学研究显示，当归挥发油对气管平滑肌有显著的解痉作用[6]，在体研究显示当归对哮喘动物模型有明显的平喘作用[7]。糖皮质激素是目前治疗急性和重症哮喘的常用药，其抗炎等作用可明显缓解哮喘的临床症状。本次实验采用大剂量氢化可的松(0.05 g/kg)来复制阴虚动物模型，同时采用该剂量来治疗哮喘，对比观察当归、氢化可的松及其合用对哮喘的治疗作用，结果显示，当归、激素及其合用能明显降低哮喘行为学评分，减少哮喘发作动物数；降低呼吸频率，增加潮气量，改善肺功能。病理学显示，当归、激素及其合用能明显缓解哮喘小鼠肺组织病理变化，降低炎性细胞对气道的浸润程度，当归与激素合用后上述作用有进一步增强的趋势。

高迁移率族蛋白B1(High-mobility group box 1,HMGB1)是一种非常保守的非组蛋白核蛋白，广泛分布于机体多种组织的细胞核中，核内的HMGB1主要调控DNA的复制及RNA的转录。在TNF-α、IL-1及IL-6等细胞因子的刺激下，释放至胞外的HMGB1与炎症细胞或直接与上述细胞因子相互作用而促进炎症反应，参与哮喘等多种炎症性疾病的发生、发展及转归[8]。TNF-α是一种促炎细胞因子，介导炎性细胞聚集，刺激其释放大量IL-6等炎性因子，参与哮喘气道的炎症反应及其重塑[9]。IL-6是一种小分子量活性多肽，在炎症反应中参与急性期反应蛋白的合成，活化T细胞以及终末分化B细胞，是气道炎症反应过程中的重要因子[10]。IL-1主要由巨噬细胞产生，其中IL-1β又名淋巴细胞活化因子，可促进嗜酸性粒细胞黏附于血管内皮细胞并浸润至气道黏膜，加速其脱颗粒而诱发哮喘[11]。本次实验显示，当归、氢化可的松及其合用能明显降低BALF中TNF-α、IL-1β及IL-6水平，当归与激素合用后的上述作用更强，同时对HMGB1的表达也产生一定的抑制作用。

激素在治疗哮喘的过程中，患者常出现喘息痰黄、腰膝酸软、五心烦热等阴虚症状[2]。实验显示，大剂量糖皮质激素可引起动物进食及饮水量增加、烦躁易动、尿黄便干等阴虚症状，现已成为复制阴虚动物模型的常用方法之一[12]。当归质地柔润，补血而使阴液充足，故有“血药补阴”之说，临床上配伍当归经常用于治疗阴虚型哮喘。本次实验显示，当归可缓解激素引起的进食量与饮水量增加、体重下降、自主活动增多等阴虚症状。

综上所述，当归、糖皮质激素及其合用对支气管哮喘有明显的治疗作用，而抑制HMGB1通路是其协同增效的机制之一；同时合用当归可明显缓解激素引起的阴虚症状。