扶正解毒通络方对人肝癌HepG2 细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制研究①

赵忠伟 曲 宁 杨 明 张景洲

(长春中医药大学附属医院,长春130021)

经临床研究表明，肝细胞癌的死亡率和发病率在世界范围内呈逐年上升的趋势，且其死亡率和发病率在各种恶性肿瘤中仍居高不下，各国人民受其影响很大。“毒损肝络”的基本理论认为是毒邪作祟、阻滞于肝络，出现络虚、毒侵，而化毒为害是络病迁延和深化的关键所在。基于以上理论，根据本科室多年临床经验拟方扶正解毒通络方，选用姜黄、当归、黄芪、桂枝等中药，使血和气行、血络通畅。肝络通达，则络虚可补，毒瘀可祛，从而达到扶正解毒通络的治疗目的。目前对于肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)发病机制的说法很多，针对其发病机制有着大量的研究，但可以确定的是，肝细胞癌无论是在体外培养的还是在体内存在的，都存在着一种现象即细胞凋亡，其凋亡的程度与快速退化组织中的凋亡相类似。本文通过制备大鼠血清，观察扶正解毒通络方低剂量、中剂量、高剂量含药血清对HepG2人肝癌细胞增殖情况的影响，对HepG2人肝癌细胞早期凋亡情况的影响，对HepG2人肝癌细胞内Bax及Bcl-2 mRNA水平的影响，对细胞内Bax、Bcl-2、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白水平的影响。以探讨扶正解毒通络方对HepG2人肝癌细胞的作用及机制，为中医药治疗HCC提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂 MTT购于美国Sigma公司；试剂Bax、Bcl-2购于美国CST公司；Caspase-3购于英国Abcam公司；SIRT3购于香港Abcam有限公司；Fas购于美国SANTA CRUI公司；P53购于上海赛信通生物试剂有限公司。

1.2实验方法

1.2.1扶正解毒通络方灌胃溶液的制备 扶正解毒通络方由姜黄20 g、黄芪10 g、当归9 g、桂枝10 g组成。将药物水煎3次，然后合并浓缩至含生药0.4 g/ml浓度。

1.2.2扶正解毒通络方含药血清的制备 SD大鼠雄性24只，随机分成空白组、扶正解毒通络方低剂量、中剂量、高剂量共4组，每组6只。空白组给予蒸馏水1 ml/100 g灌胃，低剂量组、中剂量组、高剂量组给予扶正解毒通络方1 g/kg、2 g/kg、4 g/kg灌胃，连续5 d，每日2次，于第4天结束后禁食禁水，第5天给药结束后，将大鼠麻醉(0.3 ml/100 g水合氯醛)，然后进行腹主动脉取血。静置4 h(室温)，取其上清血。与同组动物血清相融合，56℃加热30 min，即可成功灭活，将其用0.22 μm微孔滤膜于无菌环境中进行过滤除菌及分装，置于-20℃的冰箱中保存。

1.2.3HepG2细胞培养 待细胞在培养箱(37℃，5%CO2)中达到指数生长期时，消化法(0.25%胰蛋白酶-EDTA)进行传代培养。PBS吸除剩余培养液置于37℃的培养箱中进行孵育，镜下观察，尽快滴入培养液(含血清)，1 000×g离心5 min，取上清，重悬计数，置于新培养瓶以3×105～5×105cells/ml细胞数接种，置于培养箱，运用上述培养条件培养，2～3 d 进行一次传代。

1.2.4细胞活力检测 采用MTT法检测细胞活力，取生长状态良好的HepG2细胞，调整细胞悬液密度为4.5×104～5×104cells/ml范围内，在96孔细胞培养板中每孔接种100 μl，实验分为正常血清组、正常对照组、扶正解毒通络方低剂量、中剂量、高剂量含药血清组和阳性对照组(顺铂)共6组，每组6孔。将培养板置于培养箱中培养2 d(37℃，5%CO2)，正常对照组加入培养液100 μl、正常血清组加入大鼠血清培养液100 μl，扶正解毒通络方低、中、高含药血清组分别加入其对应的含药大鼠血清培养液100 μl，阳性对照组加入顺铂溶液(10 μg/ml)100 μl。并将等量的含血清培养液滴入到设定的6个平行孔中，其平行孔全部设为调零孔。继续培养(24 h),加入MTT(20 μl，5 mg/ml)，分别置于培养箱培养4 h(37℃，5%CO2)弃培养液，每孔加入150 μl DMSO，酶标分析仪速度调至中速、波长570 nm，振荡5 min，测定6孔中的OD值，计算各组不同浓度含药血清的抑制率[1]。

1.2.5RT-PCR检测细胞内Bax和Bcl-2 mRNA水平 采用Trizol提取肿瘤细胞RNA，将Trizol 1～2 ml 加入到60 mm细胞培养皿中静置3 min，取上清液置1.5 ml EP管中；2 000×g离心5 min，去沉淀；加入200 μl氯仿，震荡15 min，混匀，静置15 min；4℃下12 000×g离心15 min，4℃下加入0.5 ml 异丙醇，室温静置10 min；4℃ 12 000×g离心10 min，去上清液，RNA沉于管底；加入75%的乙醇，轻震荡，沉淀；4℃下8 000×g离心5 min，去上清液，干燥10 min(室温)；每管用被DEPC(50 μl)处理过的水溶解RNA，10 min(55～60℃)；测定A260和A280处的OD值，判断RNA的纯度并定量；将RNA逆转录为cDNA；荧光实时定量PCR。

1.2.6免疫印迹(Western blot)检测细胞中Bax、Bcl-2、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白水平 提取细胞总蛋白,BCA法测定细胞总蛋白浓度,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转膜,封闭,加入一抗与靶蛋白结合,酶标记的二抗和一抗结合,显色。

2 结果

2.1扶正解毒通络方含药血清对HepG2人肝癌细胞增殖的影响 与正常对照组比较，正常血清组人肝癌细胞HepG2的增殖无影响，差异无统计学意义(P>0.05)；与正常血清组比较，扶正解毒通络方低、中和高剂量含药血清和阳性对照组都能显著抑制肝癌细胞的过度增殖，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2含药血清对HepG2人肝癌细胞Bax和Bcl-2 mRNA水平的影响 与正常对照组比较，正常血清组人肝癌细胞HepG2胞内Bcl-2和Bax mRNA水平无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；与正常血清组比较，扶正解毒通络方低、中和高剂量含药血清和阳性对照组HepG2胞内Bc1-2基因转录减少，Bax基因转录增加，见图2、3。

2.3含药血清对HepG2人肝癌细胞Bax、Bcl-2、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白水平的影响与正常对照组比较，正常血清组人肝癌细胞HepG2细胞内Bax、Bcl-2、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白表达水平无明显改变；与正常血清组比较，扶正解毒通络方低、中和高剂量含药血清和阳性对照组HepG2细胞内Bcl-2蛋白表达减少，Bax、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白表达增加(图4)。

图1 含药血清对肝癌细胞增殖的影响Fig.1 Effect of medicated serum on proliferation of HepG2 cellNote: Compared with normal control group,*.P<0.05，**.P<0.01.

图2 含药血清对肝癌细胞Bcl-2 mRNA水平的影响Fig.2 Effect of medicated serum on level of Bcl-2 mRNA of HepG2 cellNote: Compared with normal control group,**.P<0.01.

图3 含药血清对肝癌细胞Bax水平的影响Fig.3 Effect of medicated serum on level of Bax of HepG2 cellNote: Compared with normal control group,**.P<0.01.

图4 蛋白Western blot结果Fig.4 Protein Western blot resultsNote: 1.Normal control group；2.Normal serum group；3.Low dose group；4.Middle dose group；5.High dose group；6.Positive control group.

3 讨论

临床的恶性肿瘤中，HCC是非常常见的恶性肿瘤之一，与人类所处的生存环境不断被污染和破坏有关，而且这种趋势越来越明显的加重，最终导致了大量癌症特别是肝癌的发病率呈现逐年上升的趋势。目前为止，医学界普遍认为手术切除仍然是治愈早期肝癌的最理想方法，然而，即使是对患者肿物进行根治性切除，60%以上的HCC患者在术后5年内仍将会发生转移和复发。尽管目前对于HCC患者来说，肿瘤分化程度、肿瘤大小、是否存在血管侵袭等临床因素与HCC患者治疗方案的选择及预后关系密切，但是HCC的发病机制目前仍不是十分清楚，因此，探讨HCC的发病机制及转移复发的相关因素，寻找肝癌早期诊断、早期治疗的方法和途径，是目前肝细胞癌研究过程中的重要任务之一。

根据中医络病学理论，我们提出了“毒损肝络”学说，用于治疗肝细胞癌，我们认为毒邪作祟、最终阻滞于肝络，出现络虚、毒侵，而瘀毒成为致病因素，成为络病迁延不愈和疾病不断深化的病机关键。其中，毒邪是HCC的启动因子，即“邪毒”造成“肝络之损”，最终又导致“肝络之变”；“瘀”是重要的枢纽因子，是这些慢性肝病发病甚至癌变的中心环节，也是“肝炎发展为肝硬化甚至变为肝癌”关键所在[2]。所以治疗原则上以通络为基础，兼以扶正解毒，故选用姜黄、黄芪、当归、桂枝等中药，使血和气行，血络通畅。肝络疏通调畅，则络虚得补，瘀毒得祛，达到通络治疗的目的。中药具有的疗效很多，例如祛邪扶正、补益元气等，且研究表明，中药在抑制肿瘤细胞生长的同时不会对其他正常细胞有所损伤。扶正解毒通络方是以中医学“毒损肝络”理论为基础，根据多年临床经验凝练出的抗肝癌验方，既往的临床研究表明，扶正解毒通络方可具有延长患者生存期，提高患者生存质量的功效。诱导肿瘤细胞分化、凋亡、坏死是抑制肿瘤细胞发生增殖的重要方式，其中凋亡是一种细胞死亡的正常方式，其具有一定的程序性特点，是机体清除异常分化细胞或衰老细胞的重要方法[3]。中药复方扶正解毒通络方的前期临床研究表明，该方在肝细胞癌的治疗中能够改善患者的临床症状，延长肿瘤患者的生存期，提高患者生存质量，降低患者肝功中谷丙转氨酶、谷草转氨酶等，一定程度上提高机体的免疫力，可有效抑制肿瘤的生长。

死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径是正常细胞在凋亡调控过程中依赖的三个进化保守的信号传导途径。凋亡的发生是由caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应，即caspase在凋亡诱导信号的作用下，启动型caspase先激活，从而发挥水解酶的活性，激活下游的效应型caspase，一旦效应型caspase被激活，就可以大范围的水解细胞内的靶物质，从而降解细胞内蛋白，使细胞不可逆地走向死亡。细胞的凋亡分为凋亡诱导、调控执行和效应三个阶段，最关键的凋亡执行者是caspase-3[4]。Bcl-2和Bax通过调控线粒体膜的通透性从而控制细胞色素C的释放，达到调控下游caspase-3蛋白酶活化的目的，介导细胞的存活或者死亡[5]。本实验研究表明，与正常对照组比较，正常血清组人肝癌细胞HepG2细胞内Bax、Bcl-2、活化的caspase-3基因及蛋白表达水平无明显改变；与正常血清组比较，扶正解毒通络方低、中和高剂量含药血清和阳性对照组HepG2胞内Bcl-2基因转录减少，蛋白表达减少;Bax基因转录增加，蛋白表达增加;活化的caspase-3蛋白表达增加。

Fas是细胞凋亡的重要信号分子，能够和FasL或Fas抗体结合，触发Fas所在靶细胞在短时间内发生凋亡[6]。在Fas介导的细胞凋亡中，caspase起关键性作用，caspase-3首先被激活，然后激活caspase-6,7，最终导致多种死亡底物的降解，完成诱导细胞凋亡过程[7]；沉默信息调节因子3(SIRT3)是Sirtuins家族中的成员；P53在肿瘤生长抑制过程中也发挥了重要的作用。

本实验结果显示，与正常血清组比较，扶正解毒通络方低、中和高剂量含药血清和阳性对照组HepG2细胞内Bcl-2蛋白表达减少，Bax、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白表达增加。因此，我们推测扶正解毒通络方通过上调SIRT3的表达，激活Fas，进而诱导Bax转录增加，增加Bcl-2/Bax比值，启动caspase途径，诱导肝癌细胞凋亡水平上升[8，9]。同时，SIRT3的增加还可以诱导P53表达的增加，继续诱导Bax基因表达增加[10]，最终诱导肿瘤细胞发生凋亡[11,12]。