血清基质金属蛋白酶-9在肺结核鉴别诊断中的价值分析①

廖 彥 林 翀 林明冠 钟业腾 陈少文 苏应仙 何 晶

(海南医学院第二附属医院检验科,海口570311)

肺结核是常见的呼吸道传染病。研究显示2015年全球的新发肺结核病例达1 040万例，300多万例患者死于结核病或包括结核菌感染在内的双重感染[1,2]。第四次全国结核病流行病学调查显示，我国肺结核患者占全球肺结核患者的1/4，其中传染性肺结核患者占40%，我国每年新发肺结核病例130万例，死亡病例数达到了13万，耐药肺结核感染病例高达46%，是结核菌耐药现象最严重的国家之一[3]。及时诊断和治疗的肺结核患者可达到较高的临床治愈率[4]，但在临床工作中，肺结核与其他肺部疾病的鉴别诊断仍然是一个棘手的问题。影像学诊断是诊断肺结核的主要方式，在此基础上，对患者痰结核病菌进行显微镜分析能够进一步提高肺结核的检出率，临床医生根据患者的临床症状、痰结核菌检验结核、肺部影像学检查结果可进行准确的诊断[5]。但是，一些特殊的肺结核患者可出现异常的全身或者呼吸系统临床表现，极易出现误诊或漏诊，特别是长期以来人们往往关注涂片阳性肺结核患者，而忽视了对涂片阴性肺结核的防控和治疗，易引起感染的传播和蔓延[6]。近年来，随着高分辨力CT等新型影像诊断技术相继应用于临床，肺结核的诊断效率得到一定的提高，但仍然不足以满足临床需求，这也迫使临床工作者对肺结核的诊断从经验性、X线影像和细菌学检测手段为主的阶段向分子生物学诊断发展[7]。结核菌患者还会出现炎症相关蛋白酶类物质的表达异常[8]。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一类可降解的细胞外基质蛋白酶，在结构上具有极大同源性，是一组依赖Zn2+和Ca2+的超家族成员，对维持细胞外基质的稳定性具有重要意义，而在炎症性疾病中，MMPs发挥溶解细胞外基质和破坏基膜的作用。MMP-9参与了炎症、血管形成和肿瘤侵袭转移等病理生理过程[9]。近年来的相关研究结果显示，MMP-9在肺损伤和肺纤维化等病理过程均扮演着重要的角色，MMPs和其组织抑制因子(Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMPs)比例的失衡是包括肺结核在内的多种慢性肺部疾病发生和进展的重要机制[10]，故有望作为肺结核的诊断标志物，但也有的研究报道称肺癌患者也可出现MMP-9的异常表达，因此，MMP-9是否能用于肺结核与肺癌、肺炎等的鉴别诊断仍然是一项饱受争议的问题。基于此种研究现状，本研究针对血清MMP-9在肺结核鉴别诊断中的价值进行了研究和分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取2015年8月～2017年9月医院收治的确诊为肺结核、肺炎、肺癌患者及在医院进行体检的健康志愿者各60例作为研究对象，分别作为肺结核组、肺炎组、肺癌组和对照组，所有研究对象均对本研究知情并签署知情同意书，本研究方案经我院医学伦理委员会审核通过。

1.1.1纳入标准 肺结核患者均符合世界卫生组织(WHO)制订的国际结核病控制条例及国家卫计委制订的肺结核病诊断标准，均经痰液细菌学检查、X线影像学检查、肺组织病理学检查或随访观察确诊。肺炎患者均符合人民卫生出版社出版的《内科学(第8版)》中的社区获得性肺炎诊断标准，均经X线影像学检查、痰液病原菌或血清支原体抗体检查确诊。肺癌患者均经纤维支气管镜检查、术后病理学检查确诊，并经肺部CT或MRI等影像学检查证实。肺结核和肺癌患者均为初诊病例，入组前未接受抗结核或抗肿瘤治疗。对照组研究对象均为同期在医院接受健康体检者，均经临床检查排除肺部疾病。

1.1.2排除标准 合并肝肾功能异常、自身免疫病或免疫缺陷、恶性肿瘤、肺外结核、其他肺部疾病或先天畸形、其他部位慢性炎症的患者；具有结核病史、肺部手术史的患者；年龄小于18岁；妊娠或哺乳期患者。

1.2研究方法 所有受试者临床干预前抽取静脉血。酶联免疫吸附法(ELISA法)对血清中的MMP-9水平进行检测，ELISA试剂盒由美国Abeam公司生产。①按1∶2 000的稀释度对血清样本进行稀释，取100 μl稀释后的血清样本与标准品、空白对照加入预包被抗体的96孔板；②于37℃下孵育2 h后每孔加入250 μl洗液洗板3次；③吸干水分后每孔加入100 μl生物素标记抗体，于37℃下孵育1 h后再次洗板；④每孔加入100 μl链霉素标记抗体，于37℃下孵育1 h后再次洗板，每孔加入100 μl底物后于37℃下孵育20～30 min；⑤每孔加入100 μl终止液后采用微孔板分光光度计(美国Bio-Rad公司生产)于450 nm波长下读取检测样品的吸光度；⑥通过标准品曲线读取被测样品中的MMP-9水平。

2 结果

2.1四组研究对象临床资料的比较 四组研究对象性别和吸烟史的差异无统计学意义(P>0.05)，而年龄、体质指数(BMI)的差异有统计学意义(P<0.05)，其中，肺癌组患者的年龄大于其他三组，肺结核组患者的BMI低于其他三组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2四组研究对象血清MMP-9水平的比较 对照组、肺结核组、肺炎组、肺癌组研究对象的血清MMP-9水平分别为(1 976.36±907.44)ng/ml、(4 350.45±2 574.75)ng/ml、(2 135.68±1 263.56)ng/ml和(2 590.38±1 532.84)ng/ml，差异有统计学意义(F=25.000，P<0.001)，其中，肺结核组患者的血清MMP-9水平显著高于其他三组(P<0.001)，肺炎组患者与对照组或肺癌组研究对象的血清MMP-9水平差异无统计学意义(P=0.606、0.141)，肺癌组患者的血清MMP-9水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P=0.047)。

2.3不同临床病理特征肺结核、肺癌患者的血清MMP-9水平的比较 不同痰培养结果、病变类型、病变范围的肺结核患者及不同组织类型的肺癌患者的血清MMP-9水平的差异均无统计学意义(P>0.05)，而临床分期较高、分化程度较低、发生远处转移的肺癌患者的血清MMP-9水平显著高于临床分期较低、分化程度较高、未发生远处转移的肺癌患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2、3。

2.4血清MMP-9在肺结核鉴别诊断中的价值分析 血清MMP-9在肺结核与健康人+肺炎+肺癌、健康人、肺炎、肺癌、肺炎+肺癌鉴别诊断中的AUC分别为0.739、0.769、0.751、0.699、0.725(P<0.05)。见表4、图1。

表1四组研究对象临床资料的比较

Tab.1Comparisonofclinicaldataamongfourgroupsinvolvedinthisstudy

Clinical dataTuberculosisgroup(n=60)Controlgroup(n=60)Pneumoniagroup(n=60)Lung cancergroup(n=60)F value/χ2 valueP valueAges (year)44.26±9.643)43.23±10.753)45.67±11.063)59.28±5.741)2)3)15.036<0.001Gender (male,%)28(46.67)30(50.00)29(48.33)26(43.33)0.5850.900BMI(kg/m2)22.36±3.322)3)4)24.17±4.231)24.06±4.141)23.84±3.711)6.7350.009Smoking history (case,%)19(31.67)17(28.33)19(31.67)20(33.33)0.3680.947

Note：vs the lung cancer groups,1)P<0.05;vs the control group,2)P<0.05;vs the pneumonia group，3)P<0.05;vs the lung cancer group,4)P<0.05.

Clinicopathological featuresnSera MMP-9 levelst valueP valueSputum Positive74 512.24±2713.620.3060.695Negative534 225.85±2281.21Pathology typesEmpty114 407.75±2839.520.1380.864Non-empty494 286.87±2572.23ScopeSingle leaf354 284.48±2059.560.5110.482Multiple leaf254 603.35±2781.15

表3不同临床病理特征肺癌患者的血清MMP-9水平的比较

Tab.3ComparisonofseralevelsofMMP-9inpatientswithlungcancerwithdifferentclinicopathologicalfeatures

Clinicopathological features nSera MMP-9t valueP valueTissue typesNon-small cell lung cancer492 417.82±1 339.870.4490.563Small cell lung cancer112 628.19±1 672.53Clinical stagesⅠ-Ⅱ131 887.35±1 068.423.6890.001Ⅲ-Ⅳ473 927.06±1 904.89Degree of differentiation Poorly254 171.18±1 865.524.928<0.001Middle and high352 002.44±1 536.71Distant metastasisYes214 382.62±1 775.845.901<0.001No392 054.43±1 256.87

表4血清MMP-9在肺结核鉴别诊断中的价值

Tab.4DiagnosticvalueofseraMMP-9intuberculosis

Diagnostic typeAUCSE value95%CIP valueCutoff value(ng/ml)SensitivitySpecificityTuberculosis vs health+pneumonia+lung cancer0.7390.0440.653～0.826<0.0014127.830.5330.922Tuberculosis vs health0.7690.0470.677～0.860<0.0013524.380.6000.900Tuberculosis vs pneumonia0.7510.0460.661～0.840<0.0014284.640.5330.900Tuberculosis vs lung cancer0.6990.0490.604～0.794<0.0015008.970.4330.967Tuberculosis vs pneumonia + lung cancer0.7250.0450.637～0.813<0.0014273.390.5170.908

图1 血清MMP-9在肺结核鉴别诊断中的ROC曲线Fig.1 ROC curve of serum MMP-9 in differential diagnosis of pulmonary tuberculosisNote: A.The ROC curve of serum MMP-9 in diagnosis of the pulmonary tuberculosis group in comparison of health control group,the pneumonia group and the lung cancer group；B.The ROC curve of serum MMP-9 in diagnosis of the pulmonary tuberculosis groups in comparison of the health control group；C.The ROC curve of serum MMP-9 in in diagnosis of the pulmonary tuberculosis groups in comparison of the pneumonia group；D.The ROC curve of serum MMP-9 in diagnosis of the pulmonary tuberculosis and the lung cancer group；E.The ROC curve of serum MMP-9 in diagnosis of the pulmonary tuberculosis and the pneumonia group,the lung cancer group.

3 讨论

本研究显示肺结核和肺癌患者血清MMP-9水平均显著高于健康人群，肺结核患者的血清MMP-9水平要显著高于肺癌患者。张锦萍[11]研究显示，初治肺结核患者可出现血清MMP-9水平的显著升高，尤其痰菌阳性、肺内病变广泛、肺内病变有空洞患者的血清MMP-9水平较高，在接受抗结核治疗后，患者的MMP-9水平会出现显著下降，特别是转阴患者的下降幅度更大，这提示了血清MMP-9水平的动态变化与肺结核患者的活动程度和病情转归密切相关。陈健儿等[12]研究显示，在肺结核患者的肺部组织中，也存在着MMP-9的过表达，活动性肺结核患者肺组织中的MMP-9表达水平更高。袁国平等[13]的研究结果显示，结核性脑膜炎患者脑脊液中的MMP-9水平要高于病毒性脑膜炎和非感染性神经系统患者，而且在疾病急性期的水平要高于恢复期，这可用于鉴别诊断结核性脑膜炎。但关于MMP-9在肺结核鉴别诊断中的研究则不多，一些研究中报道了MMP-9在鉴别诊断结核性胸液、恶性胸液、漏出性胸液中具有一定的价值，但也有研究结果显示，在肺癌患者的血清样本和肿瘤组织中也可检出MMP-9水平升高，其水平与肺癌的组织学分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关，并可在手术之后出现显著下降[14-16]。这些研究结果提示了肺癌患者的血清MMP-9水平也可出现升高，这可能影响其在肺结核与肺癌鉴别诊断中的临床价值，但从本研究结果可以看出，相对肺癌患者，肺结核患者的血清MMP-9水平升高更加剧烈，这能够为临床诊断提供参考依据。

本研究结果显示，血清MMP-9在人群的肺结核筛查和肺结核与肺炎、肺癌的鉴别诊断中均可能具有一定的价值，其中，在人群的肺结核筛查中的价值最高，而在与肺癌的鉴别诊断中价值最低，但在Cutoff值下，血清MMP-9的诊断灵敏度偏低，而诊断特异度较高，因此，在应用时还需要结合其他临床检查和标志物检测来提高灵敏度。近年来，关于MMP-9与肺结核发病的相关性机制研究较为缺乏，但针对其他慢性肺部疾病的研究却在一定程度上揭示了MMP-9在肺部疾病持续性炎症损伤中的作用。于嘉琛等[17]研究显示，在慢性哮喘小鼠模型的支气管上皮细胞中可出现MMP-9高表达，MMP-9表达增加与血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因的表达上调具有相关性，而二者的表达增高可能共同参与了气道壁厚度等慢性哮喘气道重塑进程。安钟健等[18]的研究结果显示，血管内皮生长因子(VEGF)/血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)/MMP-9信号通路可能是诱导大鼠模型肺纤维化的重要通路之一。潘娜等[19]的研究结果显示，MMP-9与慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)气道炎症的关系也十分紧密，MMP-9的过表达可能是导致COPD急性发作的重要原因之一。康彩云等[20]的研究结果显示，在COPD的发生和急性加重过程中，患者血清MMP-9水平的上升还与Th17细胞功能异常存在一定相关性，二者相互影响，加重COPD的自体免疫反应。可见，在多种慢性气道及肺组织异构性疾病中，MMP-9表达水平的升高均发挥了促进炎症损害、加剧免疫功能紊乱、诱导病情加重的作用。同时，国外研究针对MMP-9在其他部位结核发生和发展过程中的作用也进行了一定的报道，Ong等[21]的研究结果显示中性粒细胞分泌的MMP-9造成了血脑屏障的核心成分IV型胶原的破坏，从而降低脑组织对病原菌的抵抗能力。Chen等[22]研究显示，结核菌能够激活ERK信号通路诱导TLR2、TNF-α的表达从而引起人体细胞MMP-9表达水平的升高，这一病理变化与积液和胸膜纤维化具有密切的相关性，很有可能促进了肺结核的发病和进展，这些研究结果都提示了结核菌可通过对人体细胞的入侵和分泌相关毒素来促进组织MMP-9的高表达，进而加剧病变局部及全身的免疫失衡和炎症损害，监测患者的血清MMP-9水平有助于辅助诊断结核菌的感染和损害。

综上所述，肺结核患者表现为血清MMP-9水平的显著升高，其升高幅度高于肺癌或肺炎患者，可作为一种血清标志物用于肺结核的鉴别诊断和筛查，但应注意适当提高诊断的灵敏度。