探讨BMSCs在治疗大鼠脑损伤时的量效关系

王英杰 王 晶 石 鑫

(承德医学院，承德067000)

创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是人身体疾病中较为复杂并难以解决的器官性疾病[1]，当损伤发生后，医护工作人员除了给予常规的治疗外，并没有十分有效的治疗手段，也不能保证治疗后的功能得到良好的康复[2]。TBI现在已经被视为是影响社会、家庭、个人的经济以及生活的重要因素之一。所以，在现有的临床治疗中发现一个切实可行的治疗方案或药物，是刻不容缓的重要课题。在创伤发生后，因为大脑的海马区受到了损伤，导致其所控制的学习、记忆等功能也发生了损伤性的功能障碍[3,4]。有研究表明当TBI发生后自噬也同时被激活。自噬(Autophagy)为所有真核细胞内最为普遍的生理现象，可实现细胞本身的代谢和某些细胞器的更新[5,6]。自噬最初被认为是另一种细胞的程序化死亡，随着研究的深入发现了自噬和凋亡并不是同一概念，凋亡是导致细胞的死亡，而自噬却是对细胞结构的重复利用。所以自噬现象在实验研究中要区分对待，其他研究表明抑制自噬能减轻TBI和提高神经功能恢复[7]。本实验通过建立大鼠脑损伤模型，并使用BMSCs进行治疗，检测动物行为学的变化，以及自噬相关蛋白的表达，研究不同剂量的BMSCs移植对大鼠脑损伤治疗产生的影响，为BMSCs在临床上治疗脑损伤提供一定的实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1动物 BMSCs的供体动物：SPF级幼年雄性SD大鼠6只，3～5周龄，体重90～110 g。BMSCs的受体动物：SPF级成年雌性SD大鼠90只，体重180～220 g，均购自于北京维通利华动物公司。

1.2方法

1.2.1BMSCs的分离及培养 使用乙醚麻醉大鼠，然后处脱颈处死大鼠，在无菌的条件下将股骨和胫骨分离，暴露骨髓腔。用DMEM高糖培养基冲洗骨髓腔，并收集冲洗液，1 000 r/min低温离心10 min后弃去上清液，用10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基重悬细胞。计数后按1×106cm-2密度接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培养，48 h后进行第一次换液，第二次以后换液间隔2～3天1次。待细胞95%融合时，使用0.25%胰酶消化，按1∶2的比例进行传代，细胞传至第3代用于实验。

1.2.2实验动物与分组 SPF级健康成年雌性SD大鼠50只，体质量180～220 g。在实验前让大鼠自由进食饮水，适应性饲养1周。将50只SD雌性大鼠随机分为5组：对照组、脑创伤模型组、BMSCs治疗1组(1×106ml-1)、BMSCs治疗2组(3×106ml-1)、BMSCs治疗3组(6×106ml-1)。治疗组分别在模型建立成功后的第28天经尾静脉注射给予不同剂量的BMSCs与DMEM悬液1.0 ml。

1.2.3脑组织形态学检测 大鼠采取腹腔麻醉法，使用10%水合氯醛，按照0.3 ml/100 g的剂量对大鼠进行麻醉，麻醉后将大鼠断头，分离脑组织，于视交叉后1和6 mm的位置冠状面切开修块，最后剩下大鼠脑的海马位置，在4%多聚甲醛固定液中固定48 h，按照梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋、5 μm连续切片。进行HE染色，光学显微镜下观察，拍照留图。

1.2.4Morris水迷宫测试 对照组、模型组、BMSCs治疗1组、BMSCs治疗2组、BMSCs治疗3组大鼠分别于伤后6、7、8、9 d进行水迷宫测试。检测时，把安全岛采取随机的方式放到水迷宫四个象限(N、S、E、W)中的一个象限中，加水，高过安全岛1 cm，水的温度维持在22～24℃，摄像机及计算机会自动追踪大鼠的活动路线，以及寻找时间。180 s内仍没找到安全岛，则潜伏期时间为180 s。

1.2.5免疫印迹法检测LC-3和Beclin-1的表达量 将所获取的大鼠脑海马组织从-80℃超低温冰箱中取出，然后将脑组织剪碎，按照100 mg/1 ml的比例加入裂解液，12 000 r/min低温离心15 min，然后凝胶电泳分离后，转移至 PVDF膜上。5%脱脂奶粉37℃封闭1.5 h，一抗孵育，并在4℃环境下过夜，第二天二抗孵育2 h。用ECL显色液进行曝光，使用Image J软件进行分析，以β-actin作为内参进行半定量分析。

2 结果

2.1BMSCs的形态学观察 原代BMSCs在 48 h之内贴壁，以分散的克隆聚集方式增殖，细胞形态基本为均匀星形或梭形，核居中，偶有宽大扁平的多边形细胞。经过BMSCs纯化，其他非贴壁细胞，通过换液逐渐减少。2 周后原代细胞 95% 融合，进行传代。传代后细胞呈现漩涡状和放射状集落生长倾向，随着传代次数增加，细胞形态更为均一，为梭形成纤维细胞样，见图1。

2.2HE染色观察组织形态学改变 HE染色结果显示，在对照组中脑的组织结构没有发生改变，血管的管腔中没有发现异常，血管的管壁平整，神经细胞形态规则；在创伤后，模型组神经元细胞胞体出现形状的改变，胞浆染色降低，细胞核出现深度染色，能够看到在细胞之间出现了明显的间隙，并且伴有坏死的神经元细胞出现，治疗1、2组与模型组比较病理改变明显减轻，治疗3组没有减轻，有加重趋势出现，见图2。

图1 BMSCs的形态学观察(×200)Fig.1 Morphological observation of BMSC(×200)Note: A.Primary cells；B.The third passage BMSCs.

图2 各组HE结果(HE staining，× 200)Fig.2 Morphological observation of lung tissue in each group(HE staining，× 200)Note: A.Control group;B.Model group;C.Treatment group 1;D.Treatment group 2;E.Treatment group 3.

2.3Morris水迷宫结果 因为在脑创伤后，大鼠的运动能力会受到一定的影响，所以设置的实验时间在各每组创伤后的第6、7、8和9天进行Morris水迷宫检测。实验结果显示，模型组在伤后第8天和第9天搜索安全岛潜伏期明显要比对照组时间增加。治疗1、2组在伤后第8天和第9天搜索安全岛潜伏期要比对照组有显著的缩短，说明大鼠的记忆功能得到了一定的恢复，治疗1组的时间比治疗2组的要短，治疗3组搜索安全岛潜伏期与模型组略又增加，差异不明显，见图3和表1。

2.4LC-3和Beclin-1的Western blot检测结果 LC-3结果显示出深浅不同的双条带LC-3Ⅰ和LC-3Ⅱ。以LC-3Ⅱ的表达高低反应自噬的水平。对照组LC-3和Beclin-1蛋白有微量基础表达。与对照组相比较，模型组LC-3和Beclin-1蛋白的表达有显著升高(P<0.05)；与模型组相比，治疗1、2组蛋白表达明显减弱(P<0.05)，但仍高于对照组表达量，治疗1组的蛋白表达比治疗2组的表达相对减弱，治疗3组与模型组相比较蛋白的表达有明显的升高。见图4。

图3 水迷宫运动轨迹Fig.3 Moving track of morris water mazeNote: A.6 d;B.7 d;C.8 d;D.9 d.*.P<0.05 vs control goup；△.P<0.05 vs model group;#.P<0.05 vs treatment group.

表1水迷宫运动变化数据

Tab.1Movementdataofwatermaze

GroupsTime6 d7 d8 d9 dControl group17.454 6±3.343 515.478 4±3.548 512.265 2±1.569 18.589 1±1.326 3Model group159.667 9±3.235 7140.767 8±4.588 7102.256 7±3.458 51)77.753 2±2.857 51)Treatment group 1103.857 9±5.752 071.055 3±3.757 952.725 5±3.557 52)27.475 3±2.577 52)Treatment group 2109.768 8±3.953 179.213 8±3.445 457.572 8±3.007 92)3)30.485 1±2.434 52)3)Treatment group 3132.674 8±3.589 7122.234 4±4.125 891.456 7±3.579 52)59.457 6±3.757 82)

Note：1)P<0.05 vs Control group;2)P<0.05 vs Model group;3)P<0.05 vs Treatment group 1.

图4 各组LC-3和Beclin-1的蛋白表达Fig.4 Protein expression of LC-3 and Beclin-1 in each groupNote: A.LC-3；B.Beclin-1.*.P<0.05,treatment group 1,2 vs model group;#.P<0.05,model group vs control group.

3 讨论

BMSCs具有很强的自我更新和多方向分化的能力，BMSCs分化的顺序是从中胚层生成，从肌肉再到骨然后到软骨最后到达脂肪和肌腱[8]。已经有实验研究以及相关文献证明，BMSCs在内环境中能够向受到损伤的组织器官、炎症以及肿瘤位置进行迁移，并对组织的结构和功能进行修复。而且BMSCs自身拥有较强的免疫调节功能，进行异体移植时能够避免免疫排斥反应[9]。因此，BMSCs在临床许多疾病的治疗中都发挥了关键性的作用[10]。

本实验的结果显示：HE染色结果，模型组神经元细胞胞体发生明显改变，胞浆染色降低，细胞核出现深度染色，并且伴有坏死的神经元细胞出现，治疗1、2组同模型组比较病理可以看到有明显的减轻，治疗3组病理改变出现加重，这说明BMSCs对大鼠脑创伤后的治疗存在着一定的量效关系；Morris水迷宫结果显示，在脑创伤后，模型组在搜索安全岛所用的时间明显要比对照组所用的时间要多，治疗1、2组的搜索时间要比模型组有了明显的好转，治疗1组的用时最短，治疗3组效果不明显，这说明大鼠的空间记忆功能有了一定程度的改善，但BMSCs对大鼠脑创伤后的治疗存在着一定的量效关系；Western blot检测结果显示，模型组LC-3和Beclin-1蛋白表达出现了显著升高，与模型组相比，治疗1、2组蛋白表达明显减弱，治疗1组的蛋白表达最弱，而治疗3组与模型组相比较蛋白的表达增强，这进一步说明大鼠脑创伤后BMSCs治疗对大鼠脑创伤后的恢复起到了一定的作用，但是BMSCs与大鼠脑创伤后的治疗之间存在着一定的量效关系，本实验的结果可以得出，BMSCs能够对大鼠的脑损伤起到一定的修复作用，但是也存在着一定的量效关系，即1×106ml-1的BMSCs是最佳的治疗剂量。3×106ml-1以及6×106ml-1能够起到一定的作用，但是治疗效果不是很理想。

综上所述，本研究证实了BMSCs对创伤性脑损伤的治疗有明显的作用效果，但是BMSCs的治疗效果与移植的剂量有直接关系，为BMSCs面向临床的应用提供了有力的理论和实验依据。