慢性乙型肝炎患者血清miR-21水平对肝纤维化程度的评估价值

李文庭 赵宗豪 李宜

肝纤维化是各种慢性肝病包括乙型肝炎发展成为肝硬化和肝癌的必经阶段。早期肝纤维化是可逆的[1-2]。因此，早期准确诊断肝纤维化对指导临床治疗具有重要的意义。

肝脏病理是肝纤维化分期的金标准。然而，其有创性以及不可重复性限制了临床应用。同时，取材以及读片的误差使得肝脏病理并不能完全准确地反映肝纤维化程度。基于此，近年来，学者们又开发出了多种无创诊断方法，包括瞬时弹性成像(TE)等[3]，但这些检测易受多种因素的影响，如患者体型，肝功能(炎症)，体位等[4]。而前期研究结果显示，经典血清学检测指标，如HA、PCⅢ、CⅣ、LN，FIB-4等，其灵敏度和特异度均较低[5]。因此，学者们不断地寻找新的无创诊断指标。

微小RNA (micro RNA，miR) 是一类高度保守的非编码RNA分子，长度约为18～22 nt，能调控基因表达，具有广泛的生物学效能。miR-21被证实在肝纤维化以及肝癌的发病机制中发挥重要作用[6]。然而，关于miR-21在慢性乙型肝炎患者疾病发展过程中是否发挥作用，以及血清miR-21水平能否评估肝纤维化分期，尚无相应研究。本研究纳入73例慢性乙型肝炎患者，检测血清miR-21水平，并分析其与肝纤维化分期的相关性，探索其诊断价值，报道如下。

资料和方法

一、材料

(一) 一般资料 纳入2014年7月至2018年4月在我院感染科住院的慢性乙型肝炎患者73例。其中男性48例，女性25例，平均年龄(41.8±12.0)岁。患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准[7]。排除标准包括：(1)其他嗜肝病毒感染，如甲型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎；(2)酒精性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎、脂肪肝等；(3)合并原发性肝癌或转移性肝癌；(4)其他病因导致的肝脏慢性病变，如血吸虫肝病，肝血管瘤，布加综合征等。所有患者均签署知情同意书，且获安徽省立医院伦理委员会批准。

(二)材料试剂 RNA 抽提试剂盒购于天根生化科技有限公司(北京)，miRNA逆转录试剂盒以及qPCR试剂盒购于金斯瑞生物科技有限公司(南京)。

二、方法

(一)病毒学以及生化指标检测 所有患者均进行血常规，血生化以及乙型肝炎病毒学检测，由我院检验科完成。

(二) 肝穿刺以及病理学检查 73例慢性乙型肝炎患者均行肝脏病理检查。肝穿刺在B超引导下进行，采集的肝组织标本由我院病理科包埋，切片。对组织切片进行HE以及Masson's 染色，并由2位病理医生独立阅片进行肝纤维化分期。具体分期标准参照2015年颁布的《慢性乙型肝炎防治指南》纤维化分期标准[7]。

(三) qPCR检测患者血清miR-21水平 逆转录按照说明书进行，取2 μg RNA，加入逆转录酶 1 μL，引物 2 μL， dNTP 0.8 μL,Bufffer 2 μL，加ddH2O配成20 μL体系进行逆转录。具体条件为：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min ，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，反应结束后4 ℃保存。

qPCR按照相关说明书进行。逆转录成cDNA后，取cDNA 2 μL, 加入qPCR Mix 10 μL，引物各2 μL，ddH2O 4 μL。qPCR在 Applied Biosystems 7 500中完成。具体条件为：95.0 ℃，10 min；95.0 ℃，10 s；60.0 ℃，20 s；72.0℃，10 s，35个循环；使用2-△△Ct法计算miR-21的表达量。miR-21引物为：Forward，5′-ACGTTGTGTAGCTTAT CAGACTG-3′，Reverse 5′-AATGGTTGTTCTCCA CACTCTC-3′。

三、 统计学分析

结 果

一、 73例慢性乙型肝炎患者一般资料

对73例患者一般资料进行了分析：年龄为 (41.8±12.0)岁；ALT 为(41.7±38.5) IU/L；AST为(29.7±17.6) IU/L；按照血清病毒定量分组(lg拷贝数/mL，<3, 3～5, >5)，各组例数分别为 27、16、30。

二、 73例患者血清miR-21的表达

根据病理学检查，73例患者肝纤维化分期为F0(6例)，F1 (29例), F2(23例), F3(10例), F4(5例)。各组患者血清miR-21表达：F0为0.702±0.105; F1为0.881±0.330; F2为1.234±0.340; F3为1.441±0.255; F4为1.762±0.212。相关分析结果显示，血清miR-21水平与肝纤维化分期呈显著正相关(r=0.683，P<0.05)，与乙型肝炎病毒量无显著正相关关系(r=0.416，P<0.05)。

三、 ROC曲线分析血清miR-21的诊断效能

为明确miR-21对慢性乙型肝炎患者的肝纤维化诊断效能，使用ROC曲线分析。结果表明，分别以血清miR-21值 ≥0.9835，≥1.150和≥1.557为cut-off值诊断F2、F3及F4，其曲线下面积分别为0.860 (95%CI, 0.774～0.946)，0.854(95%CI, 0.768～0.940), 0.929(95%CI, 0.8648～0.995)，见表1。

表1 血清miR-21诊断慢性乙型肝炎肝纤维化的诊断

(A)随着肝纤维化程度的增加，血清miR-21表达升高; (B)随着病毒载量增加，血清miR-21表达升高；*P<0.05

讨 论

肝脏受到损伤时，肝细胞以及小叶结构被破坏，肝细胞结节状再生[8]。同时，肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)活化，分泌大量的细胞外基质(extracellular Matrix，ECM)沉积在肝脏，分隔包围再生肝细胞，形成假小叶。因此，HSC 活化是肝纤维化的核心机制[9]。在慢性乙型肝炎过程中，免疫细胞活化并释放大量的细胞因子，如转化生长因子β1(transforming growth factor，TGF-β1)[10]，加速肝纤维化的形成。

miR-21已被证实在TGF-β1诱导的纤维化进程中发挥重要作用。TGF-β1 体外能诱导miR-21-5p表达，而体外高表达miR-21-5p后，TGF-β1诱导的纤维化进程加速，其机制可能是通过调节miR-21-5p表达。与其他病因不同，乙型肝炎肝纤维化有着独特的发病机制。目前研究显示HBx基因能上调肝细胞miR-21表达[10]，这也解释了单纯拮抗TGF-β1并不能有效地抑制乙型肝炎肝纤维化[11]。这也为miR-21成为乙型肝炎肝纤维化的诊断指标提供了理论依据。

本研究结果显示，随着肝纤维化分期的升高，患者血清miR-21水平逐渐增加，两者具有显著正相关关系。随着血清病毒载量升高，患者血清miR-21水平逐渐增加，两者有显著正相关关系，值得进一步研究。使用ROC曲线进一步探索miR-21的诊断价值，结果显示以血清miR-21值 ≥0.9835，≥1.150和≥1.557为cut-off值诊断F2、F3及F4，其曲线下面积分别为0.902，0.875, 0.884。与前期结果相比，血清miR-21对肝纤维化的诊断效能明显高于HA, PCⅢ, CⅣ和LN诊断。因此，可认为血清miR-21具有较好的肝纤维化诊断价值。

肝纤维化分期对慢性乙型肝炎治疗方案的制定以及疗效随访具有重要的临床意义。相对于肝脏穿刺组织病理学检查而言，血清学检查简单、快速、无创伤，可重复性高，亦可避免肝穿刺的取材误差。同时，血清miR-21可反映患者体内病毒复制状态。因此，本研究结果提示可以通过乙型肝炎患者血清miR-21水平评价肝纤维化的分期。

本研究尚存在一些不足，病例数偏少，且缺乏长时间随访观察。因此，今后需要扩大样本量，延长随访时间，从而进一步优化血清miR-21的诊断效能，为该指标的临床应用提供充分的理论支持。