氧化苦参碱改善肝硬化大鼠细胞凋亡性肠黏膜损伤的机制

文剑波 陈卫国 张潇 江丽萍 胡兆鹏 周云

肝硬化门静脉高压通过破坏肌动蛋白细胞骨架和紧密连接复杂结构，增加肠上皮细胞的凋亡和改变刷状缘以及表面活性剂层的组成损伤肠黏膜机械屏障，而大量肠黏膜上皮细胞的凋亡破坏了肠上皮细胞间紧密连接(TJ)的结构，损伤肠黏膜屏障的功能。Bcl-2、Bax是Bcl-2家族中作用相反、有同源结构域的一组基因，与肠上皮细胞的凋亡有着密切的联系。现代药理研究表明，氧化苦参碱(OMT)具有抗氧化[1]、抗肿瘤[2]、抗凋亡[3]、抗炎[4]、抗病毒[5]、抗纤维化[6]等多种药理作用。有研究发现，OMT通过抑制Caspase-3和Bax的表达，增加Bcl-2的表达抗细胞凋亡及增加抗氧化酶活性减少新生大鼠缺氧缺血性脑损伤[7]。本实验旨在探究改良四因素复合造模法制备的肝硬化大鼠模型中，OMT能否通过上调Bcl-2和下调Bax的表达来抑制肠黏膜上皮细胞的凋亡，从而改善肠黏膜损伤。

资料和方法

一、材料

(一)实验动物 正常雄性SD大鼠30只，体质量(200±20) g(湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供)。置于萍乡市人民医院动物实验中心饲养，温度18～22 ℃，自由摄食及饮水。

(二)实验试剂及仪器 四氯化碳溶液、医用橄榄油(上海国药集团化学试剂有限公司)，TRIZOL(美国INVITROGEN公司)，逆转录试剂盒(美国Genecopoeia公司)，罗氏Tunel试剂盒(美国Sigma公司)，苦参素注射液(江苏正大天晴药业股份有限公司)，PCR仪(美国Bio-Rad公司)，电泳仪(北京六一仪器厂)等。

二、方法

(一) 分组及模型准备 30只SD大鼠，随机分为空白组(4只)、肝硬化造模组(26只)。空白组：常规饲养9周后，按体质量肌注5%葡萄糖水4周，消毒自来水及饲料自由摄入，标记为空白对照组A组；肝硬化造模组：采用改良四因素复合造模法(苯巴比妥钠诱导、CCl4橄榄油溶液皮下注射、乙醇甘草甜味素溶液作为饮用水)9周后制成肝硬化成模大鼠(16只)，造模过程中，分别于第5、7、9 周各随机抽取1只大鼠行肉眼及光镜下观察肝脏病理改变，观察是否造模成功。取肝硬化成模大鼠16只，随机选择8只予以40% CCl4橄榄油溶液皮下注射及按体质量肌注5%葡萄糖水4周，标记为模型组B组；剩余8只予以40% CCl4橄榄油溶液皮下注射及按体质量肌注OMT葡萄糖水4周，标记为治疗组C组；B组和C组消毒饲料及含甘草甜味素的10%乙醇溶液自由摄入。

(二)TUNEL法检测肠组织中肠上皮细胞的凋亡 固定、取材、石蜡包埋、切片后按罗氏TUNEL说明书对各组大鼠末端回肠黏膜组织肠上皮细胞行凋亡检测，并计算凋亡率。

(三)RT-PCR法检测大鼠肠组织Bcl-2和Bax的mRNA表达 引物合成(引物序列见表1)、TRIZOL法抽提大鼠回肠末端组织总RNA、反转录合成第一链cDNA、cDNA扩增、琼脂糖凝胶电泳、Gelpro4.0版凝胶光密度分析软件分析图像结果。

(四)统计学分析

结 果

一、肉眼及光镜下肝脏病理改变

造模过程中，分别于第5、7、9 周各随机抽取1只大鼠行肉眼及光镜下观察肝脏病理改变。结果显示，9周末大鼠肝脏明显肝硬化(如图1)。说明肝硬化大鼠造模成功。

二、 TUNEL肠组织肠上皮细胞凋亡结果

模型组(图2B)回肠上皮细胞凋亡率明显高于空白对照组(图2A) (40.98%±2.19%对7.87%±1.83%)，差异有统计学意义(P<0.01)；治疗组(图2C)凋亡率低于模型组(28.27%±2.30%对40.98%±2.19%)，差异有统计学意义(P<0.05)。(如图2，3)

表1 引物序列

图1 肉眼观察肝脏及镜下病理表现(HE，×100)

A：空白对照组；B模型组；C药物治疗组

注：A:空白对照组; B:模型组; C:治疗组.**P<0.01:模型组对空白对照组,*P<0.05:治疗组对模型组

图3回肠组织TUNEL染色细胞凋亡率条形图

三、回肠组织中Bcl-2和Bax mRNA表达结果

电泳结果表明，A组中Bcl-2 mRNA呈现高表达，Bax mRNA呈现低表达。B组Bcl-2 mRNA的表达明显低于A组，差异有统计学意义(P<0.01)；Bax mRNA表达明显高于A组，差异有统计学意义(P<0.01)；C组Bcl-2 mRNA的表达水平明显增加高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；Bax mRNA的表达水平明显减少低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)。(如图4、5、6)

注：A:空白对照组; B:模型组; C:治疗组

图4Bcl-2和Bax mRNA电泳图

注：A:空白对照组; B:模型组; C:治疗组.**P< 0.01:模型组对空白对照组,*P<0.05：治疗组对模型组

图5Bcl-2 mRNA水平比较

注：A:空白对照组; B:模型组; C:治疗组.**P< 0.01:模型组对空白对照组,*P<0.05：治疗组对模型组

图6Bax mRNA水平比较

讨 论

肝硬化后期门静脉高压、营养不良低蛋白血症、肠道动力不足、内毒素血症、促炎性细胞因子TNF-α的水平升高[8]、氧化应激(OS)等都可导致大量肠上皮细胞发生凋亡，而肠上皮细胞大量凋亡减少了上皮细胞群的数量引起TJ的分离、肠通透性增加，进而损害肠黏膜机械屏障。细胞凋亡基因Bcl-2、Bax可以分别以同源及异源二聚体存在，当Bax高表达时形成同源二聚体Bax-Bax诱导细胞凋亡；而Bcl-2高表达时则形成异源二聚体Bcl-2-Bax抑制细胞凋亡。且随着Bcl-2表达增加，同源二聚体Bax-Bax大量分离与Bcl-2形成更加稳定的异源二聚体Bcl-2-Bax，从而抑制同源二聚体Bax-Bax诱导的细胞凋亡，因此，Bcl-2/Bax的比值可以判断细胞生存还是死亡[9]。OMT是从豆科槐属植物苦参中提取的具有四环喹嗪啶类结构的生物碱，有文献报道可通过促进Bcl-2表达而抑制苯巴比妥钠诱导的肝细胞凋亡[10]。另一项研究表明，相较于醛固酮抑制剂螺内酯通过抑制钙蛋白酶/凋亡诱导因子(AIF)介导的信号通路导致心肌细胞凋亡，OMT具有同样的效果而无高钾血症的副作用[11]。本研究也验证了OMT可通过调控细胞凋亡基因Bcl-2、Bax的表达抑制肠黏膜上皮细胞的凋亡，与其他研究结果一致。

本研究TUNEL法检测肠上皮细胞凋亡结果表明，模型组肠细胞凋亡率明显高于空白对照组，经OMT治疗后，药物治疗组细胞凋亡率明显下降低于模型组；肝硬化大鼠肠组织Bcl-2 mRNA表达明显低于空白对照组，Bax mRNA表达高于空白对照组，经过OMT治疗后，药物治疗组Bcl-2 mRNA的表达水平明显增加高于模型组，Bax mRNA的表达水平明显减少低于模型组。这提示OMT治疗可通过上调细胞凋亡基因Bcl-2mRNA、下调Bax mRNA的表达，从而抑制肠黏膜上皮细胞的凋亡。前期研究发现CCl4诱导的肝硬化大鼠肠黏膜受到严重破坏，而OMT可以减轻肠黏膜绒毛的水肿以及修复腺上皮柱状结构，并显著降低炎性细胞浸润而改善肝硬化大鼠的肠组织损伤。其机制可能一方面OMT通过抑制NF-κB介导的炎症信号通路降低肠黏膜炎症细胞因子如TNF-α、IL-6的浓度水平及减轻肠源性内毒素血症改善肝硬化大鼠肠上皮屏障功能[12]；另一方面，其机制可能是OMT通过上调肝硬化大鼠回肠组织中凋亡相关基因Bcl-2 mRNA的表达、下调Bax mRNA的表达抑制肠黏膜上皮细胞的凋亡，从而改善肠黏膜损伤，发挥保护肠黏膜屏障功能的作用。