微波预处理对小麦面筋蛋白糖基化改性的影响

杨雪飞 臧艳妮 赵妍嫣 罗水忠 姜绍通 郑 志

(合肥工业大学食品科学与工程学院；安徽省农产品精深加工重点实验室，合肥 230009)

小麦面筋蛋白，又称谷朊粉，其氨基酸组成齐全、来源广泛，是一种营养丰富且经济的植物蛋白[1]。小麦面筋蛋白具有良好的黏弹性、可降解性及成膜性[2,3]，被广泛应用于焙烤食品及生物可降解材料领域[4,5]。然而小麦面筋蛋白含有大量的疏水性氨基酸，导致其溶解性较差，进而影响其功能性质，限制了其应用范围[6,7]。

蛋白质的糖基化是依据美拉德反应的基本原理，由蛋白质分子侧链上的自由氨基与糖分子还原末端的羰基之间发生的羰氨反应[8]。该反应是由蛋白质和还原糖经加热自发进行的，不需要加入任何其他化学试剂，是一种相对理想的化学改性方式，能够有效的改善蛋白质的溶解性、乳化性、起泡性、凝胶性、热稳定性等功能性质[9-11]。基于小麦面筋蛋白是一种结构紧凑的球蛋白，一些反应基团可能被包裹在分子内部，使得蛋白分子与糖分子不能充分接触，不利于糖基化反应的进行[12]。通过对小麦面筋蛋白进行适当的预处理，可以使其结构变得松散，反应基团暴露，促进糖基化反应的发生。

微波处理可以产生高频电磁场，使反应体系中的极性分子随着频率的改变而来回振动，产生热能[13]。微波加热时，能够断裂蛋白质中的二硫键，使蛋白中的游离巯基含量增加，且在微波加热的过程中，蛋白质的疏水基团暴露，提高蛋白质的溶解性[14]。张海华等[15]对微波处理后小麦面筋蛋白结构的变化进行了研究，发现微波能够减弱小麦面筋蛋白分子间/分子内的非共价作用，断裂二硫键，破坏小麦面筋蛋白的结构，使其变得松散。谢欢[16]探究了微波对蛋清蛋白糖基化反应的影响，结果表明随着微波功率和时间的增加，美拉德反应程度逐渐增高。本实验采用微波预处理小麦面筋蛋白，再进行糖基化改性，研究改性前后小麦面筋蛋白溶解性和乳化性的变化，探究微波处理对小麦面筋蛋白糖基化效率的影响机制，为拓宽其应用范围提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦面筋蛋白、葡萄糖、大豆油、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)、十二烷基磺酸钠、ANS 、考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白其他化学试剂为分析纯。其中小麦面筋蛋白的组成如表1所示：

MM823LA6-NS微波炉；PHS-3C雷磁pH计； FD-1B-50冷冻干燥机；UDK152全自动凯氏定氮仪； UV757CRT紫外可见分光光度计；Nicolet 67傅里叶红外光谱仪；Bio-Rad电泳仪。

表1 小麦面筋蛋白的基本组成

1.2 改性小麦面筋蛋白样品的制备

配制5%的小麦面筋蛋白溶液，磁力搅拌1 h使其分散均匀，将小麦面筋蛋白溶液置于频率为3.0 GHz的微波炉中采用不同功率处理(70、210、350、560、700 W)，处理时间为60 s，将所得小麦面筋蛋白样品分别标记为WG-0、WG-70、WG-210、WG-350、WG-560、WG-700。处理结束后，一部分样品进行冷冻干燥、备用；另一部分用1 mol/L的NaOH调节pH至12.0，再加入等质量的葡萄糖，磁力搅拌1 h，使两者充分混匀，用1 mol/L的HCl调节pH至10.0，密封后放入80 ℃水浴摇床中反应1 h，反应结束后迅速冰浴冷却至室温，离心(8 000 r/min，20 min)，取上清液置于透析袋中透析24 h，冷冻干燥，即得到复合改性的小麦面筋蛋白，分别记为WG-G0、WG-G70、WG-G210、WG-G350、WG-G560、WG-G700。

1.3 测定方法

1.3.1 接枝度测定

参照Lertittikula等[17]的方法进行接枝度测定，取125 μL糖基化样品蛋白溶液与2 mL 0.21 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH 8.2)混合，再加入1 mL 0.01%的TNBS溶液，振荡混匀，在50 ℃水浴中避光反应1 h，之后加入2 mL 0.1 mol/L Na2SO3溶液，室温冷却30 min，于420 nm处测定吸光值At。以相同条件下加入125 μL未经水浴加热的小麦面筋蛋白溶液作为空白对照，在420 nm下测定其吸光度值A0，按下式计算接枝度。

式中:A0表示未反应样品吸光度；At表示反应t时间后样品吸光度。

1.3.2 褐变程度及中间产物测定

参考文献[18]的方法稍作修改。糖基化反应的中间产物在294 nm处有吸光值，褐变程度可以用420nm处的吸光值进行测定。取2.0 mL样液用蒸馏水稀释一定的倍数，以蒸馏水作空白对照，分别测定294 nm和420 nm处的吸光值。

1.3.3 溶解性测定

将微波处理的和复合改性的小麦面筋蛋白分别用蒸馏水配制成1%的样品溶液，室温下搅拌，使其分散均匀。然后用1 mol/L的NaOH/HCl溶液将pH分别调节为4～10，震荡混匀，离心(8 000r/min，20 min)，采用考马斯亮蓝法[19]测定上清液中的蛋白含量。利用牛血清蛋白作标准曲线，根据上清液中蛋白含量与溶液中总蛋白含量比值计算糖基化产物的溶解性。

1.3.4 乳化性测定

参照文献[20]的方法测定乳化性。分别取24 mL 2 mg/mL 微波处理的样品溶液和复合改性的样品溶液(样品蛋白溶于0.2 mol/L，pH 8.2磷酸盐缓冲液中)，边搅拌边缓慢加入8 mL大豆油，高速均质(10 000 r/min，25 ℃，1 min)。而后分别在0 min和10 min时从所制乳状液的底部取样液50 μL，加到5 mL质量分数为0.1% SDS溶液中，测定其在500 nm处的吸光值(A0，A10)，以相同质量分数的SDS溶液作空白。乳化活性指数(EAI，m2/g)和乳化稳定性指数(ESI，min)的计算公式如下：

式中：DF为稀释倍数，DF=100；C为样品浓度，g/mL；φ为光程，φ=1 cm；θ为乳液中油相所占比例，θ=0.25；A0为0 min时测定的吸光度；A10为10 min时测定的吸光度。

1.3.5 表面疏水性测定

参照Wang等[21]的方法。取100 mg微波处理样品及微波-糖基化复合处理样品分别分散于15 mL pH 7.0的0.01 mol/L 磷酸缓冲液中，于7 000 r/min离心10 min，采用考马斯亮蓝法测定上清液蛋白浓度。将上清液稀释至不同的浓度梯度(分别稀释1、0.75、0.50、0.25和0.125倍)，再取40 μL ANS试剂(8.0 mmol/L)加到4 mL上述蛋白溶液中，选择激发波长365 nm，发射波长484 nm，测定不同浓度样品蛋白的荧光强度，以荧光强度对蛋白质浓度作曲线，将曲线的最开始的斜率定义为被检测样品的表面疏水度H0。

1.3.6 SDS-PAGE电泳

参照Wang[22]的方法并稍作修改，选用12%的分离胶(pH 8.8)和5%的浓缩胶(pH 6.8)。将蛋白样品溶于0.125 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)的缓冲液(含5% SDS、10% β-巯基乙醇、20%甘油和0.5%溴酚蓝)中，配制成20 mg/mL的样品溶液。而后在沸水浴中煮沸5 min，7 000 r/min离心15 min，取上清液10 μL上样。电泳过程采用恒压模式，电泳结束后，将凝胶分别进行考马斯亮蓝R-250染色和PAS(Perodicacidschif)反应染色，脱色液脱色，最后进行拍照，观察亚基条带变化。

考马斯亮蓝R-250染色方法：电泳凝胶在0.1%的考马斯亮蓝R-250溶液中染色1 h，而后置于甲醇∶冰醋酸∶水=1∶1∶8的脱色液中脱色，直至背景色脱去。

PAS染色参照Guan[23]和王玉琪[24]的方法并稍作修改。将凝胶先用10%三氯乙酸进行蛋白固定25 min，蒸馏水冲洗2～3次。然后用高碘酸室温氧化15 min，蒸馏水洗涤2～3次，加入Schiff试剂避光染色1 h，染色结束后，采用0.5%的偏重亚硫酸钠(现用现配)洗涤干净，于醋酸溶液保存。

1.3.7 红外光谱分析

（三）无论是对于自然界，还是实际生活中的化学物质、现象，都应保持必要的探究欲、好奇心，使自身的学习兴趣得到进一步的拓展；促使物质观的初步建立，懂得世界应是物质的，而物质又是变化的，能用辩证思维来看待事物本质，摒弃一些迷信观念，使得崇尚科学的思想得以树立等。

准确称取2 mg样品，按照1∶100的比例加入溴化钾，经研钵研磨后压制成薄片，采用傅里叶红外光谱仪进行全波段扫描(400～4 000 cm-1)，扫描次数32次。

1.3.8 荧光光谱分析

参照文献[25]的方法稍作修改。将复合改性的样品溶于0.2 mol/L pH 8.2磷酸盐缓冲液中，配制成蛋白浓度为5 mg/mL的样品溶液，离心(8 000 r/min，10 min)，取50 μL上清液于石英比色皿中，使用荧光分光光度计在激发波长280 nm、狭缝宽5 nm的条件下，测定样品蛋白在300～500 nm范围内的荧光发射光谱。

1.3.9 数据处理

所有的实验均至少进行3次重复，数据以平均值±标准差的形式表示。数据的显著性(P<0.05)通过SPSS软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 接枝度测定

接枝度是测定溶液中游离氨基的变化，常被用来反映糖基化反应蛋白质中的游离氨基和还原糖中的羰基的共价结合的程度[26]。不同微波功率处理结合糖基化复合改性小麦面筋蛋白的接枝度变化如图1所示。

图1 微波功率对复合改性小麦面筋蛋白接枝度、褐变程度和中间产物含量(A294)的影响

由图1可知，在0～350 W时，小麦面筋蛋白的接枝度随着微波功率的增加而增大，当微波功率为350 W时，小麦面筋蛋白的接枝度达到最大。这是由于经过微波处理后，小麦面筋蛋白的致密结构被破坏，暴露出更多的糖基化反应位点，有利于糖基化反应的发生。当微波功率大于350 W时，接枝度反而下降。因此，适度的微波处理有利于糖基化反应的发生，使接枝度增大。

2.2 褐变程度及中间产物测定

由图1可知，随着微波功率的增大，反应体系在294 nm处的吸光值呈现出先增大后减小的变化，在微波功率为350 W处的吸光值最大；当微波功率大于350 W时，吸光值减小，这是由于功率过大，使得已经松散的小麦面筋蛋白结构重新聚集，导致糖基化反应受阻，中间产物(A294)生成量减少。而反应体系在420 nm处的吸光值呈现出不断增大的趋势，这可能是由于糖基化反应是一个复杂连续的反应过程，不断发生糖基化反应产物间的加成或聚合反应，生成更多的类黑精物质，从而吸光值不断增大。

2.3 复合改性对小麦面筋蛋白溶解性的影响

蛋白质可应用性的重要参考指标之一就是溶解性，溶解性的好坏也会影响蛋白质的其他功能性质，如乳化性、起泡性、凝胶性和流变学特性等。微波-糖基化复合改性小麦面筋蛋白在不同pH条件下的溶解度如图2所示。

从图2a可以看出与未经微波处理的小麦面筋蛋白相比，微波处理小麦面筋蛋白的溶解性明显提高(P<0.05)，且随着微波功率的增大呈现先增大后减小的变化，这是由于适当的微波处理小麦面筋蛋白能够减弱蛋白分子间/分子内的非共价作用，致使小麦面筋蛋白结构变得松散，溶解性增大。由于蛋白结构变松散，使得更多的糖基化反应位点得以暴露，从而促进糖基化反应的发生，同时引入更多含有亲水羟基的糖链，提高了糖基化产物的溶解性[27]，这也是在相同pH条件下，微波-糖基化复合改性小麦面筋蛋白的溶解性较微波处理小麦面筋蛋白的溶解性显著提高(P<0.05)的原因。由图2b中也可以看出小麦面筋蛋白经糖基化改性后等电点发生向左偏移的变化，这可能是因为小麦面筋蛋白共价交联含有多羟基的葡萄糖，与游离氨基共价交联使其电荷发生变化，从而导致等电点发生变化[28]。

图2 微波处理及微波-糖基化复合改性对小麦面筋蛋白溶解性的影响

2.4 复合改性对小麦面筋蛋白乳化特性的影响

微波处理和微波-糖基化复合改性对小麦面筋蛋白乳化活性和乳化稳定性的影响如图2.3所示。

由图3可知，未改性的小麦面筋蛋白的乳化活性和乳化稳定性分别为9.03 m2g-1和4.59 min。微波处理后小麦面筋蛋白乳化活性和乳化稳定随着微波功率的增大呈现先增大后减小的趋势，在微波功率为350 W时达到最大，为41.65 m2g-1和11.99 min。对比可以看出，小麦面筋蛋白经微波-糖基化复合改性后，其产物乳化活性和乳化稳定性显著提高(P<0.05)。有报道称小麦面筋蛋白乳化特性增加与蛋白质溶解性的增加，以及疏水性基团暴露程度增加有关[29]。Dickinson等[30]研究表明：无表面活性的亲水性糖分子可以通过增强蛋白膜的厚度来提高蛋白的乳化性和乳化稳定性。微波-糖基化复合改性小麦面筋蛋白的乳化活性提高，这是由于当葡萄糖以共价键连接入小麦面筋蛋白肽链中，增加了空间阻力，使得界面蛋白很难发生聚合，从而提高其乳化稳定性。而过度的预处理，就会使得蛋白分子重新聚集，糖基化反应减弱，乳化活性也随之降低。

图3 微波功率对糖基化小麦面筋蛋白乳化活性和乳化稳定性的影响

2.5 SDS-PAGE电泳分析

将小麦面筋蛋白-葡萄糖糖基化产物进行SDS-PAGE电泳分析，分别采用考马斯亮蓝法、PAS法进行染色以表征蛋白质及糖蛋白。微波-糖基化复合改性小麦面筋蛋白的电泳图如图4所示。

图4为不同功率微波-糖基化小麦面筋蛋白产物的电泳图，不难看出，小麦面筋蛋白经过微波-糖基化改性后，有较大分子量的聚合物生成。这可能是因为热处理过程中，小麦面筋蛋白的亚基产生聚集，形成了分子量更大的聚合物。该聚合物不能顺利通过浓缩胶和分离胶，因此在P1处出现黑色条带，这与程熙茜[31]的电泳结果相一致。经过对凝胶进行PAS染色发现，在P1和P2处有红色的条带显现，这说明小麦面筋蛋白与葡萄糖发生了共价交联，生成了糖蛋白。且红色条带的颜色随着微波功率的增大而出现先增大后减小的变化，当微波功率为350 W时，红色条带颜色最深，这说明此时生成的糖蛋白量最多。这与之前接枝度的测定结果相一致。

注：M为蛋白质标品，1为天然小麦面筋蛋白，2～7分别为0、70、210、350、560、700 W的微波-糖基化复合改性的小麦面筋蛋白。图4 复合改性小麦面筋蛋白样品的SDS-PAGE电泳图谱

2.6 表面疏水性分析

表面疏水性可以反映蛋白的空间构象变化。微波处理和糖基化改性对小麦面筋蛋白表面疏水性的影响如图5所示。

图5 微波处理及糖基化改性对小麦面筋蛋白表面疏水性的影响

由图5可看出，经微波处理后，小麦面筋蛋白的表面疏水性显著增加，但微波功率超过350 W后，其表面疏水性开始降低，这是由于适当的微波可以使物料内部分子间发生摩擦，破坏分子间的共价键/非共价键[32]，使小麦面筋蛋白结构变得松散，内部的疏水区域增多。而当微波预处理的小麦面筋蛋白经过糖基化改性后，小麦面筋蛋白分子与含有较多亲水性羟基的糖链发生共价交联，蛋白质的亲水性增强，表面疏水性降低。

2.7 红外光谱分析

微波-糖基化复合改性小麦面筋蛋白的傅里叶红外光谱如图6所示。

图6 复合改性小麦面筋蛋白样品的红外光谱图

由图6可以看出，微波-糖基化复合改性小麦面筋蛋白产物的红外光谱图中各吸收峰强度较仅糖基化改性的小麦面筋蛋白均有不同程度的增加，且微波功率为350 W时的吸收峰强度最大。由红外图谱分析发现，当小麦面筋蛋白经过糖基化改性后，其分子结构发生了改变，具体反映为小麦面筋蛋白功能基团的变化。如3 367 cm-1处的吸收峰增强，这可能是因为糖基化反应过程中，葡萄糖分子的共价交联，从而出现游离羟基在3 700～3 200 cm-1处的伸缩振动，这同时也说明适当的微波功率可以促进糖基化反应的发生，使小麦面筋蛋白与葡萄糖发生共价交联反应[33]，这与Sun[34]等研究结果一致。

位于1 700～1 600 cm-1范围的酰胺Ⅰ带经常被用来分析蛋白质的二级结构，如α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲[35]，通过对红外光谱中的酰胺Ⅰ带进行去卷积，二阶导数拟合后，计算出微波-糖基化复合改性小麦面筋蛋白的二级结构含量如表1所示。

由表1可知，微波-糖基化复合改性小麦面筋蛋白样品中α-螺旋含量显著下降，在微波功率为350 W时，α-螺旋含量降到最低。这是由于稳定α-螺旋的作用力主要是多肽链的氢键，而微波处理和糖基化改性影响了氢键的稳定。此外α-螺旋含量随着微波功率的上升呈现出不同的变化，表明适当的微波处理可以改变小麦面筋蛋白的空间构象，促进糖基化反应。同时，二级结构中的β-折叠和无规则卷曲结构的含量上升，进一步说明微波-糖基化复合改性改变了小麦面筋蛋白的二级结构，部分α-螺旋结构转换为β-折叠和无规则卷曲结构。由于β-结构和无规则卷曲结构较α-螺旋结构的稳定性差，从而使得蛋白质的灵活性增强。Kato等[36]指出蛋白分子柔性越大，乳化性越好，因而微波-糖基化改性能够改善蛋白质的溶解性和乳化性等功能特性。

表1 复合改性小麦面筋蛋白样品二级结构的变化

注：同一列中不同小写字母代表具有显著性差异(P<0.05)

2.8 荧光光谱分析

荧光光谱是一种有效分析研究蛋白空间构象的技术手段[37]。由于糖基化反应过程会产生具有荧光特性的产物，所以可以通过分析荧光光谱来表征小麦面筋蛋白糖基化产物的结构。

图7 不同微波功率处理小麦面筋蛋白糖基化产物的荧光光谱的变化

由图7可知，复合改性小麦面筋蛋白在354 nm处有最大荧光吸收，这验证了小麦面筋蛋白糖基化产物具有荧光性。先前的报道称[35]糖基化反应所产生的荧光物质主要来源于氨基化合物的Streeker降解或是糖基化反应中间产物的进一步反应形成的。由图7可看出，微波-糖基化改性小麦面筋蛋白的荧光强度高于单独糖基化改性的小麦面筋蛋白，且随着微波功率的增加，复合改性小麦面筋蛋白样品的荧光强度呈现先增加后降低的变化，当微波功率为350 W时荧光强度最大，表明适当的微波功率可以促进糖基化反应进程，加快糖基化反应速度。

3 结论

研究微波处理和糖基化改性对小麦面筋蛋白功能特性及结构的影响。结果表明：适当的微波处理结合糖基化复合改性小麦面筋蛋白，可以提高其溶解性及乳化特性，当微波功率为350 W时，溶解性最大，且乳化性及乳化稳定性最好，分别为41.65 m2g-1和11.99 min；适当的微波预处理能够使小麦面筋蛋白的结构变得松散，疏水基团暴露，提高其表面疏水性，而与糖接枝后，由于引入了较多的亲水性羟基，又导致表面疏水性下降；SDS-PAGE电泳、傅里叶红外光谱及荧光光谱分析表明小麦面筋蛋白与葡萄糖发生了共价交联，且微波预处理对小麦面筋蛋白糖基化反应具有促进作用。