DPP4抑制剂高产菌株的筛选、鉴定及发酵特性

(光明乳业股份有限公司乳业研究院,上海乳业生物工程技术研究中心,乳业生物技术国家重点实验室,上海 200436)

糖尿病(DM)是一种以高血糖为特征的内分泌代谢疾病,其中90%以上患者罹患2型糖尿病(T2DM)。2016年世界卫生组织(WHO)称,中国糖尿病人数达到1.14亿人,约占中国成年人总数的1/10,已严重危害人民群众的健康和生命[1]。随着对T2DM发病机制的深入研究,二肽基肽酶-4(DPP-4)逐渐成为治疗糖尿病的新靶点[2]。DPP-4抑制剂通过抑制体内DPP-4活性,提高体内胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽(GIP)的浓度,进而促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素的分泌而发挥降血糖作用,并且能改善胰岛α及β细胞功能[3]。目前临床上使用的DPP-4抑制剂属于列汀类药物,在使用过程中会有胃肠道和皮肤不适、过敏和肌骨失常等不良反应[4-8]。因此,筛选和设计新型的DPP-4抑制剂,仍是当前口服降糖药的开发热点之一。

天然来源的DPP-4抑制剂与化学合成的列汀类药物相比,具有作用温和、安全性高以及副作用小等优点而备受关注。目前,海洋鱼类[9]、乳蛋白(包括牛、马、牦牛和骆驼)[10-13]、豆类植物[14,15]以及各种发酵食品(包括纳豆、酸奶和干酪等)[16-19],是天然DPP-4抑制剂的重要来源,其中有大量研究是通过各种蛋白水解酶,水解酪蛋白或乳清蛋白而生成的多种乳源性DPP-4抑制肽[20]。Lacroix等[21]利用胃蛋白酶(Pepsin)水解牛乳清蛋白中的β-乳球蛋白,发现酶解得到的LKPTPEGDL和LKPTPEGDLEIL小肽,对DPP-4的IC50值分别为45和57 μmol/L。Nongonierma等[22]将胰蛋白酶(Trypsin)水解骆驼奶,发现源自骆驼奶中的β-酪蛋白的LPVP和MPVQA小肽,对DPP-4的IC50值分别为(87.0±3.2) μmol/L和(93.3±8.0) μmol/L。

当前通过微生物发酵制备DPP-4抑制剂的研究还处于起步阶段。在DPP-4抑制剂体外筛选模型中的阳性对照物Diprotin A,是来自蜡样芽孢杆菌(B.cereus)BMF673-RF1在以马铃薯淀粉为主要培养基经发酵、分离和纯化得到三肽(Ile-Pro-Ile)[23]。Sato等[24]从纳豆中发现两个二肽,KL和LR均具有强烈的DPP-4抑制活性,其IC50值分别为(41.40±2.68) μg/mL和(598.02±18.35) μg/mL。此类研究开辟了通过微生物发酵,制备DPP-4抑制剂的新方法。但是,目前相关报道还相对较少,还需寻找新的菌株和发酵方法。

本研究从江南传统酸豆角汁中分离并筛选出,具有强烈乳蛋白水解能力的菌株,并以脱脂乳为培养基,进行具有抑制DPP-4活性菌株的筛选以及相关发酵特性的研究,以期为后续工业化生产乳源性DPP-4抑制剂奠定理论基础和技术指引。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

江南传统酸豆角汁 共3份均来自江苏苏州地区;瑞士乳杆菌(L.helveticus)BD3909 由光明乳业股份有限公司提供;干酪乳杆菌(L.casei)ATCC334和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)ATCC53103 购自美国ATCC公司;嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCFM、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)LB340和动物双歧杆菌(B.animalis)BL-04 均由美国杜邦公司提供;嗜热链球菌(S.thermophilus)ST-BODY-3 丹麦科-汉森公司提供;M17培养基 英国OXOID公司;MRS培养基 德国Merck公司;NB培养基、TPY培养基和TYC培养基 青岛海博生物技术有限公司;小麦麸皮(Wheat bran,WB) 陕西西安斯诺特生物技术有限公司;脱脂乳粉(skimmed milk,SKM) 新西兰恒天然集团;DPP-4(EC3.4.14.5,from human recombinant,≥10 U/mg protein)、甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺盐酸盐(H-Gly-Pro-pNA·HCl)和Diprotin A 美国Sigma-Aldrich试剂公司;细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司;KOD One PCR试剂盒 日本TOYOBO生物试剂公司;其他化学试剂 均是分析纯,来自国药集团化学试剂有限公司。

HVE-50型高压灭菌锅 日本HIRAYAMA公司;GNP-9270型隔水恒温培养箱 上海精宏试验设备有限公司;SG-402TX型超净工作台 美国BAKER公司;PB-100型pH计 德国Sartorius公司;HZQ-X500C大型恒温振荡器 上海一恒科学仪器有限公司;Spectra Max M5多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司;65518型CELLSTAR 96孔微孔板 奥地利Greiner Bio-One公司;Pellicon超滤系统、Millipore-Q超纯水仪 德国默克-密理博公司;Biofuge Strators高速冷冻离心机 德国Heraeus 公司;Micro 17R微量台式离心机、11-500-108H型电炉 美国Thermo Fisher Scientific公司;FreeZone冻干机 美国LABCONCO公司;Proflex 3x32梯度PCR仪 美国Applied Biosystems公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制备

1.2.1.1 分离培养基 称取M17琼脂培养基4.8 g溶解于100 mL蒸馏水中,121 ℃灭菌15 min,冷却备用。

1.2.1.2 2%(W/V)脱脂乳(SKM)琼脂平板 配制20 mL 10%(W/V)脱脂乳,再取1.4 g琼脂粉溶于80 mL水中,分别于115 ℃灭菌15 min后,在65 ℃培养箱中放置30 min,两者混匀后,倒入无菌平板中,配成2%(W/V)SKM琼脂平板。

1.2.1.3 LB液体培养基 分别称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母抽提物和10 g NaCl,溶解于1 L去离子水中,121 ℃灭菌15 min,冷却备用。

1.2.2 菌株分离和纯化 采用逐级稀释法将江南传统酸豆角汁,用无菌生理盐水稀释至原浓度10-4,分别取原液以及各级稀释液(10-1、10-2、10-3和10-4)0.1 mL均匀涂布于M17琼脂培养基上,于37 ℃厌氧培养2 d后,观察并挑取菌落形态(形状、大小和色泽等)有显著差异的单菌落,并划线于2%(W/V)SKM固体培养基上,置于37 ℃厌氧培养2 d进行二次纯化后,置于4 ℃冰箱中,予以备用。

1.2.3 发酵种子液的制备 挑取1.2.2中在2%(W/V)SKM固体培养基上,有明显蛋白水解圈的单菌落,共计11株,接种于10 mL 10%(W/V)SKM液体培养基中,于37 ℃静置培养24 h后,10000×g离心15 min,取沉淀(菌饼),以相同体积的无菌蒸馏水反复洗涤三次后重悬,即得发酵种子液,予以备用。

1.2.4 具有DPP-4抑制活性菌株的筛选 将这11株菌的发酵种子液以2%(V/V)接种量,接种于10%(W/V)SKM液体培养基中(装量为100 mL/250 mL锥形瓶),37 ℃静置培养48 h,得发酵乳。再将各个株菌的发酵乳,分别置于沸水浴中加热10 min灭活菌体,10000×g离心15 min,弃沉淀,得上清液。上清液用5.0 mol/L NaOH调节pH至8.0,再次10000×g离心15 min,取上清,并冷冻保存,用于DPP-4抑制活性测定。

1.2.5 菌株鉴定

1.2.5.1 形态学分析 纯化后的菌株BD3736在2%(W/V)SKM固体培养基平板上,在30 ℃好氧培养4 d后观察菌落形态和色泽。通过革兰氏染色法对菌体染色,在光学显微镜(10×100)下观察,并根据《伯杰氏系统细菌学手册》[25]进行鉴定。

1.2.5.2 生理生化特征分析 通过Biology微生物鉴定系统进行生长实验与化学敏感实验[26];部分生理生化鉴定参见《常见细菌系统鉴定手册》[27]。

1.2.5.3 菌株的分子生物学鉴定 菌株接种至LB液体培养基,37 ℃振荡培养24 h后,采用细菌DNA提取试剂盒,抽提菌株BD3736的DNA。采用细菌16S rRNA基因的通用引物:27F(5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′),扩增片段长度约为1500 bp。PCR反应体系为20 μL:Buffer 2.0 μL,dNTPs 1.6 μL,EXTaq酶0.2 μL,引物各0.5 μL(浓度10 μmol/Lol/L),模板50 ng。PCR扩增程序:94 ℃预变性1.5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,35个循环;72 ℃充分延伸5 min,10 ℃保存。反应结束后,移取10.0 μL PCR反应产物于1.0%(W/V)琼脂糖凝胶,90 V电压,30 min电泳后,经凝胶成像系统检测结果。PCR扩增产物送至生工生物(上海)有限公司测序,测序结果在NCBI进行BLAST分析,利用MEGA X软件构建系统发育树[28]。结合形态学观察及生理生化试验结果,最终确定菌株BD3736的种属关系。

1.2.6P.polymyxaBD3736的发酵特性

1.2.6.1 不同乳酸菌的发酵乳对DPP-4的抑制活性 取不同乳酸菌的冻干粉少量,分别划线于对应的固体培养基上(BD3909、ATCC334、NCFM和LB34于MRS培养基,ST-BODY-3于M17培养基,BL-04于TPY培养基),以37 ℃厌氧培养2 d形成菌落,随后参照“1.2.3”和“1.2.4”方法制备各个乳酸菌的种子液和发酵乳,测定不同乳酸菌的发酵乳上清对DPP-4的抑制率(n=3)。

1.2.6.2P.polymyxaBD3736在不同培养介质中对DPP-4的抑制活性P.polymyxaBD3736种子液按2%(V/V)接种量,分别接种于MRS、M17、TYC、NB、TPY、4%(W/V)小麦麸皮(WB)和10%(W/V)SKM的液体培养基中,(装量为100 mL/250 mL锥形瓶),37 ℃静置培养2 d后,发酵结束后,测定各个P.polymyxaBD3736发酵液对DPP-4的抑制率(n=3)。

1.2.6.3 不同发酵条件对P.polymyxaBD3736产DPP-4抑制活性影响 先将P.polymyxaBD3736种子液按2%(V/V)接种量,接种于10%(W/V)SKM液体培养基中,分别置于30 和37 ℃条件下,进行厌氧(静置)和好氧(180 r/min摇床振荡)培养2 d得发酵乳,发酵结束后,比较各个样品对DPP-4的抑制率和IC50值(n=3)。

1.2.6.4P.polymyxaBD3736在SKM培养基中pH和活菌数的变化 将P.polymyxaBD3736发酵种子液以2%(V/V)接种量,接种于10%(W/V)SKM液体培养基中(装量为100 mL/250 mL锥形瓶),30 ℃、180 r/min摇床振荡培养,于0、3、6、9、12、24和36 h取样,分别测定各个时间点发酵体系的pH和活菌数(n=3)。

1.2.7 DPP-4抑制活性及IC50值测定 DPP-4抑制活性的测定参考Li-Chan等[9]试验方法,并稍作修改。用0.1 mol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液(Tris-HCl Buffer,pH=8.0,)溶解或稀释待测样品,并取25 μL待测样品于96孔微孔板中,加入25 μL 1.6 mmol/L H-Gly-Pro-pNA·HCl溶液(0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液为溶剂),混匀,37 ℃孵育15 min,再加入50 μL 5 U/L DPP-4溶液(0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液为溶剂),混匀,37 ℃反应60 min,最后加入100 μL 1.0 mol/L 醋酸/醋酸钠缓冲液(pH=4.0)终止反应。通过酶标仪在405 nm波长下,测定吸光度值(A)。同时,为了避免SKM自身对DPP-4活性的影响,而导致假阳性产生。本研究以SKM溶液作为阴性对照,其制备方法如下:用乳酸将已灭菌的10%(W/V)SKM液体培养基,调节至待测发酵样品相同pH,水浴煮沸10 min,10000×g离心15 min后取上清,以5.0 mol/L NaOH回调pH至8.0,再次10000×g离心15 min,取上清,即得阴性对照组。取三次平行试验的平均值,代入以下公式计算对DPP-4的抑制率(%),并以Diprotin A为阳性对照。

式中,阴性对照:为空白脱脂乳替代待测样品;阴性空白:为Tris-HCl缓冲液替代阴性对照组中的DPP-4溶液;样品空白:为Tris-HCl缓冲液替代待测样品组中的DPP-4溶液。

IC50值测定:通过倍半稀释的方法将待测样品进行稀释,获得不同浓度的待测样品组,利用上述测试方法,测定不同浓度的待测样品对DPP-4的抑制率。根据待测样品的浓度与DPP-4抑制率所构成的线性关系,计算得出待测样品对DPP-4的IC50值。

1.3 数据处理

试验至少重复3次,所有数据用SPSS 22.0软件处理。试验结果采用GraphPad Prism 7.0软件作图,测定结果以平均值±标准差表示(Mean±SD)(n=3)。

2 结果与分析

2.1 具有DPP-4抑制活性菌株的筛选

利用逐级稀释法从3份酸豆角汁中,通过M17固体培养基选择性培养,共分离纯化获得59株菌株,其中11株菌在2%(W/V)SKM固体培养基上,有明显乳蛋白水解能力(形成水解圈),并依次编号为BD3736、BD3738、BD3739、BD3740、BD3808、BD3809、BD3817、BD3818、BD3819、BD3842和BD3844。对这11株菌以10%(W/V)SKM为发酵培养基,所制备的发酵乳,进行DPP-4抑制活性的测定。结果如图1所示,发现菌株BD3736发酵48 h所得的发酵乳,对DPP-4具有强烈的抑制活性,其抑制率为66.4%±2.9%,显著高于其他菌株,因此,菌株BD3736被选择作为潜在具有抑制DPP-4活性的菌株来进一步研究。

图1 不同菌株的发酵乳对DPP-4的抑制活性Fig.1 Effect of skim milk fermented by different strains on DPP-4 inhibition activity注：对于同一测定指标，不同小写字母表示差异显著(P<0.05);图5～图8同。

2.2 菌株BD3736鉴定结果

2.2.1 形态学特征 从图2(A)可知,菌株BD3736在2%(W/V)SKM固体培养基上,单菌落呈现圆形凸起,颜色为乳白色,有褶皱,直径为4～6 mm,并具有明显的粘稠特征。同时,菌株BD3736具有很强的乳蛋白水解能力。从图2(B)可知,菌株BD3736的微观形态呈杆状,革兰氏染色为阳性菌,菌株BD3736的芽孢大小为0.2～0.3 μm,见图2(C)。

图2 菌株BD3736的菌落形态(A)、革兰氏染色(B)和芽孢状态(C)Fig.2 The colony morphology(A),gram staining(B)and spore state(C)results of strain BD3736

2.2.2 生理生化特征 按照《常见细菌系统鉴定手册》(第8版)对菌株BD3736进行生理生化试验,结果如表1所示。菌株BD3736的耐盐性为5%,在10%含盐培养基上无法生长;在糖发酵反应中,可以利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖、甘露糖和半乳糖等多种碳源。厌氧生长,硝酸还原反应和水解酪蛋白均为阳性;柠檬酸钠利用和H2S产生为阴性;并且能在10～45 ℃范围内生长。根据菌株BD3736的生化反应及形态学特征,初步判断其为类芽孢杆菌属或芽孢杆菌属。

表1 菌株BD3736的生理生化特征Table 1 Physiology and biotechnical charateristics of BD3736

2.2.3 菌株BD3736基因序列分析结果 以16S rRNA基因特异性引物进行PCR扩增,在1000～2000 bp之间获得一条特异性的扩增条带,且条带清晰明亮(图3)。该条带经切胶、纯化等操作,测序得到16S rRNA基因长度为1447 bp。通过16S rRNA的测序结果,与已公布的序列比对分析,发现菌株BD3736与类芽孢杆菌属的菌株处于同一大的分支(图4),其中与多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)DSM 36聚类在一起,进化距离最近,相似度为99.72%。因此,结合形态、生理生化和16S rRNA基因分析,菌株BD3736鉴定结果为多粘类芽孢杆菌,并命名为PaenibacilluspolymyxaBD3736。同时,在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏,专利保藏号为CGMCC 10062。

图3 菌株BD3736的16S rRNA基因Fig.3 Electrophoresis profile of 16S rRNA gene from strain BD3736 by PCR

图4 菌株BD3736基于16S rRNA序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of the strain BD3736 based on 16S rRNA sequences

2.3 P. polymyxa BD3736与其他乳酸菌的比较

由图5可知,其他6株不同乳酸菌的发酵乳,对DPP-4的抑制率差异较大,大部分乳酸菌的抑制活力较低(抑制率<20%),其中只有L.caseinATCC334对DPP-4的抑制活性为27.6%±3.4%,而P.polymyxaBD3736发酵乳的抑制效果为最佳,显著优于其他乳酸菌(P<0.05)。P.polymyxaBD3736在以脱脂乳为培养介质,具有合成DPP-4抑制剂的特性尚未报道过。因此,P.polymyxaBD3736的研究值得进一步深入开展。

图5 不同乳酸菌对DPP-4的抑制效果Fig.5 Inhibition activity of different lactic acid bacteria on DPP-4

2.4 P. polymyxa D3736在不同培养介质中产DPP-4抑制活性

从图6可知,P.polymyxaBD3736在以脱脂乳(SKM)为培养介质时,其发酵产物对DPP-4抑制效果最高,其次是以营养肉汤(NB)为介质,抑制率为32.8%±2.5%。P.polymyxaBD3736在其他类型的培养介质中的发酵产物,对DPP-4的抑制率均<20%。P.polymyxaBD3736以脱脂乳为培养介质,利用自身较完整的蛋白水解酶体系,具有水解成多种生物学功能的乳源性小肽或多肽。

2.5 发酵条件对P. polymyxa BD3736的DPP-4抑制活性影响

如图7所示,在30 ℃和37 ℃培养温度与好氧或厌氧条件下,获得四组发酵乳,其DPP-4的抑制率及IC50分别为:90.6%±2.6%和(14.2±2.0) mg/mL(30 ℃、好氧)、80.0%±2.5%和(18.9±2.1) mg/mL(37 ℃、好氧)、73.3%±2.9%和(23.1±1.3) mg/mL(30 ℃、厌氧)以及67.3%±3.0%和(27.1±2.3) mg/mL(37 ℃、厌氧)。在好氧条件下,P.polymyxaBD3736在培养温度30 ℃下的发酵乳,其DPP-4的抑制活性高于37 ℃条件下的发酵乳,并且前者的IC50值也低于后者。在相同培养温度下,来自摇床培养的发酵乳的DPP-4抑制活性,显著高于静置培养(P<0.05)。由此可见,30 ℃培养温度、好氧培养是P.polymyxaBD3736发酵脱脂乳产DPP-4抑制剂的优选条件,该条件与类芽孢杆菌家族菌株的最适生长条件一致[29]。因此,根据DPP-4抑制效果与菌体在SKM中生长的正相关性,为后续P.polymyxaBD3736工业化制备DPP-4抑制剂奠定基础。

图7 发酵条件对P. polymyxa BD3736产DPP-4抑制剂的影响Fig.7 Effect of fermentation conditions on DPP-4 inhibitor by P. polymyxa BD3736

2.6 P. polymyxa BD3736在SKM培养基中的生长情况

由图8可知,在发酵前期,P.polymyxaBD3736在脱脂乳中的生长趋势与保加利亚乳杆菌等乳酸菌类似[30],呈典型的“S”型生长曲线,尤其在6～9 h时,菌体由于生境营养充足,且活力旺盛的关系,导致增殖速率最快(活菌对数值8.08→8.79),直至12 h时达到活菌数峰值1.05×109CFU/mL,随着发酵时间的延长,活菌总数开始缓慢下滑至5.50×108CFU/mL(24 h),并一直保持至发酵终点(36 h)。

在pH变化方面,P.polymyxaBD3736发酵体系的pH呈现快速降低现象(pH6.40→5.64)，主要出现在发酵前12 h,继续延长发酵时间至36 h,其发酵终点pH为5.58,此时对DPP-4抑制活性为64.33%±6.6%,见图8(B)。该现象的产生与常规乳酸菌完全不同,后者的发酵乳终点pH较低(5.0以下),主要由于乳酸的大量积累[31]。P.polymyxaBD3736发酵乳终点pH较高,除了少量乳酸的贡献外,菌株自身分泌的多种乳蛋白水解酶将酪蛋白水解成偏酸性的小肽和氨基酸,也可能是影响pH的重要因素之一。因此有利于后续DPP-4抑制剂的工业化放大生产。

图8 P. polymyxa BD3736在SKM液体培养基中的生长情况Fig.8 Growth of P. polymyxa BD3736in SKM liquid medium注:A:菌株BD3736的生长曲线和pH变化;B:菌株BD3736对DPP-4的抑制活性。

3 结论

多粘类芽孢杆菌属于类芽孢杆菌模式菌种,其被美国环保署(EPA)列为可在商业上应用的微生物之一,我国农村农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。本研究从江南传统酸豆角汁中,分离纯化并鉴定出一株多粘类芽孢杆菌BD3736,其具有强烈的乳蛋白水解能力,并以10%(W/V)SKM为培养基,在30 ℃、180 r/min条件下,培养2 d时的发酵乳,对DPP-4的抑制率为90.6%±2.6%,IC50值为(14.2±2.0) mg/mL。P.polymyxaBD3736在脱脂乳培养基中的生长情况也符合类芽孢杆菌的生长特性,但又不同于常见的酸奶菌株,无大量乳酸生成,为后续分离纯化DPP-4抑制剂排除了诸多干扰。同时,此研究为进一步开发新型、副作用低的口服降糖药物或功能性食品配料提供理论基础和技术支持。