重组禽流感（H5+H7）二价灭活苗免疫抗体监测与分析

郁再洛 罗强

（广西凌云县动物疫病预防控制中心 533199）

禽流感(Avian Influenza,AI),主要由正黏病毒科的A型流感病毒所引起的传染病，流行范围广，传播速度快，病死率高，亚型多，变异快，其中H5和H7亚型对养禽业和人类身体健康危害严重，被世界动物卫生组织（OIE）列入A类动物疫病，我国列为一类动物传染病[1]。凌云县地处广西西北部，云贵高原东南边缘地带，北连乐业县，西接田林县，东临河池市的凤山、巴马两县，南靠右江区。总面积2053平方公里，其中40%为喀斯特山区。由于特殊的地理位置，动物防疫基础设施薄弱，防疫力量不足，活禽及产品流通频繁，导致禽流感疫情风险加大，2017年发生人际间感染H7N9流感，发病3人，死亡2人，禽流感防控的形势异常严峻。近年来，凌云县把免疫工作作为防控禽流感的主要措施来抓，广泛开展禽流感免疫血清学抗体监测，旨在对免疫工作进行客观评估，为科学指导防控工作提供依据。

1 材料及方法

1.1 样品来源

2018年春秋季集中免疫结束后，随机抽全县8个乡镇44个养禽场和172个农村散养户的健康家禽，共采样831份，其中养殖场440份，占52.94%，水禽样品226份，占31.52%。采样家禽经过重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗首免或二次免疫，疫苗来自政府统一采购的肇庆大华农生物药品有限公司（批号01721164）、乾元浩生物股份有限公司（批号2018099）、青岛易邦生物工程有限公司（批号182364500）。疫苗免疫接种方法及剂量按相关产品说明书规定操作。

1.2 试剂

哈尔滨维科生物技术开发公司生产的禽流感H5亚型（Re-8株）血凝抑制试验抗原，批号2018001、2018007；禽流感H7亚型（H7N9株）血凝抑制试验抗原，批号2017012、2018007。

1.3 检测仪器

单道、多道移液器，微量振荡器，96孔V型血疑板，离心机等。

2 检测方法及判断标准

参照国标《高致病性禽流感诊断技术》 （GB/T 18936-2003）标准，通过血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）的方法检测H5、H7亚型抗体。以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。HI效价≥4log2判断为合格，群体合格率达70%以上达标。

3 结果及分析

3.1 抗体合格情况

检测结果显示，禽流感H5亚型和H7亚型抗体总体合格率分别为83.27%、87.97%，二者的抗体效价差距不大，但H7亚型优于H5亚型。养殖场和农村散养禽流感H5、H7亚型抗体合格率分别为81.36%、85.42%和85.42%、90.79%，养殖场的抗体合格率比较散养户略低。鸡禽流感H5、H7亚型抗体合格率分别为85.45%、90.79%，水禽禽流感H5、H7亚型抗体合格率分别为79.38%、83.2%，说明鸡的禽流感H5、H7亚型抗体合格率比水禽高。详见表1。

表1 禽流感H5、H7亚型抗体检测情况（单位：份、%）

表2 禽流感H5、H7亚型一免、二免抗体检测情况表（单位：份、%）

附图 禽流感H5、H7亚型抗体滴度分布

3.2 抗体滴度分布情况

试验结果表明，所检的831个样品中H5亚型有770份样品检测出抗体，占92.65%，H7亚型有782份样品检测出抗体，占94.1%。HI效价≥4log2以上的分别占83.27%、87.97%，且维持在较高的抗体水平状态，群体合格率达到农业农村部70%以上的规定要求，详见附图。

3.3 禽流感H5、H7亚型一免、二免抗体检测情况

查阅免疫档案记载，所检样品中有337个样品是经过二次免疫后采集，其H5亚型和H7亚型抗体检测合格率分别为87.83%、91.39%，通过一免禽流感H5亚型和H7亚型抗体合格率分别为80.16%、85.63%，由此可见，经过二免后的鸡或水禽其抗体水平均比一免高，详见表2

4 小结与讨论

（1）从监测结果来看，2018年凌云县禽流感H5、H7亚型免疫抗体合格率都比较高，免疫应答显著，临床观察接种后副反应小，群体合格率均超过国家规定标准，说明重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活苗免疫原性良好，安全有效，该苗的推广使用避免了单苗注射，降低了成本，减少家禽应激次数，实现一次免疫同时防控H5和H7两种亚型禽流感流行毒株的目的，对防控禽流感提供有效的免疫保护作用[2]。

（2）在检测结果表明，不同免疫程序、不同饲养方式、不同禽类别其抗体效价有差异。凌云县规模养殖场的抗体合格率略低于散养户的主要原因是部分养殖场由场主自行开展，没有配备专业技术人员，没有按免疫程序开展二免，加上饲养管理水平欠缺，环境条件差易导致家禽营养不良，影响免疫应答。而散养户家禽虽然免疫密度相对较低，但免疫由乡镇动物防疫合作社统一进行，技术相对成熟，且部分血清又来自于动物防疫示范村，按示范要求均进行了二免。同时笔者注意到，由于春秋两防的检测结果作为年度绩效考评的依据，一些防疫员企图通过随意加大注射剂量和免疫次数来提高抗体合格率，相反造成免疫抑制或麻痹，其抗体水平不一定很理想。此外，凌云县散养户及养禽场的饲养周期均超100d，只是在春秋季集中进行禽流感免疫，不能按规定的日龄计划免疫，对禽流感的免疫效价和保护作用有一定的影响。

（3）本次监测的样品主要采集来自春秋两防后的家禽，样品的来源有一定的局限性，数量也相对较少，不一定完全反映抗体水平。监测中对不同季节、不同日龄禽类、蛋禽、种禽的流感抗体水平情况，还得不到全面的掌握和了解。检测方法仅采用血凝和血凝抑制（HA-HI），没能采用禽流感病毒间接ELISA抗体检测方法进行定性分析，相互印证和参考。

（4）在检测过程中，实验室环境温度湿度，抗原的标定，红细胞的来源及浓度，血凝反应板的光洁度，抗原与抗体、红细胞的作用时间，待检血清、抗原、BPS液的污染程度、冻溶次数及操作人员的熟练程度等很多因素对血凝抑制试验（HI）的结果有一定影响[3]，从而导致漏判或误判。实验中对4单位病毒配比比例准确性至关重要，每次试验一定要对4单位抗原进行凝集性回归试验，确保检测的准确性。试验中笔者经常遇到出现2～3孔有凝集现象而影响判断，需要除去存在血清中的非特异凝集素，方法是在56℃水浴30min，加入同体积的1%鸡红细胞，混匀，室温静置30min，1500r/min离心8min后取上层血清进行检测，判断结果时增加一个HI滴度。也有报道称，采用待检血清同种家禽的红细胞，减少非特异凝集，有待于论证和探讨。

5 提高禽流感免疫效果的主要技术措施

5.1 制定切实可行的免疫程序

根据检测结果、禽病的流行特点和饲养管理水平制定合理的免疫程序，生长期超过70d的肉鸡场实行两次免疫，15～20日龄进行第一次基础免疫，间隔3周后再进行一次加强免疫。农村散养家禽实施集中免疫，对超免疫期或新补栏家禽及时补免。

5.2 规范免疫技术操作

免疫时做到操作规范、程序合理、部位准确、剂量充足、安全保定、消毒规范。实施免疫前了解畜禽健康状态，对器械严格消毒，疫苗必须在2～8℃的条件下保存、运输，使用前进行预温，油乳剂要充分摇匀，疫苗使用时最好1h用完。

5.3 加强畜禽的饲养管理

在对家禽免疫接种时要加强对畜禽的饲养管理，保持栏舍干净卫生，通风良好，均衡饲料营养，投喂黄芪多糖、电解多维等提高家禽的免疫应答，减少应激，免疫前后尽量不使用含抗生素、磺胺类的药物和饲料。

5.4 强化家禽免疫监测效果评估工作

定期对散养户、养殖场采取集中监测、常规监测和随机检测相结合的办法，开展家禽免疫抗体效价评估，总结免疫中存在的问题和不足，提出整改措施，对未达到免疫抗体保护水平的应及时补免。

5.5 提高防疫队伍业务素质

禽流感免疫技术性强，涉及面广，工作难度大。在免疫工作开展前，要组织开展形式多样的宣传、技术培训和指导，提高防疫队伍业务素质和养殖者的防疫意识，规范免疫操作，落实免疫档案制度，确保免疫工作可追溯，全面提高防疫密度和防疫质量，建立稳固的免疫屏障，从而有效地控制禽流感疫情的发生。