藻酸钙银离子抑菌敷料无菌试验方法研究

栾同青 张萌萌 王文庆 郝树彬 山东省医疗器械产品质量检验中心 （山东 济南 250101）

内容提要： 根据中国药典2015年版四部无菌检查法，建立适用于藻酸钙银离子抑菌敷料的无菌试验方法，通过方法适用性试验确定：约1cm×3cm大小的检验量在200mL的培养体系中无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，可按此方法进行无菌检查。

银作为抗菌剂使用由来已久，银离子、可溶性银化合物、表面积大的胶态银、纳米银等均具有杀灭革兰氏阳性菌（G+）、革兰氏阴性菌（G-）、真菌及部分病毒的作用[1-3]。藻酸钙银离子抑菌敷料可用于处理轻微擦伤、裂伤、割伤、烫伤与烧伤；也可用于压疮、手术后伤口、腿部溃疡、糖尿病足部溃疡和部分皮层烧伤等有大量渗液伤口的处理，作为防止微生物渗透的有效屏障，抑制微生物生长，有助于减轻伤口的感染。

藻酸钙银离子抑菌敷料与患者创伤组织直接接触，按《医疗器械分类规则》规定属第二类或第三类医疗器械，并且具有广谱抗菌作用。按照《中国药典》[4]规定，“进行产品无菌检查时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。”本研究以藻酸钙银离子抑菌敷料为对象，拟采用扩大培养基用量稀释抗菌剂浓度的方法，建立适用于该藻酸钙银离子抑菌敷料的无菌试验方法。

1.仪器与材料

1.1 仪器

培养箱(Memmert IPP750plus、BINDER KB400）、厌氧工作站（ELECTROTEK AW200SG）、超净工作台（ESCO AVC-6D1）、电子天平（Sartorius BSA822）、生物安全柜（Thermo 1300 SERIES B2）、双扉灭菌器（Systec DX-200-2D）、压力蒸汽灭菌器（SANYO MLS-3780）。

1.2 材料

1.2.1 培养基

硫乙醇酸盐流体培养基（批号：160602）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：160918），购自于北京陆桥技术股份有限公司；胰酪大豆胨琼脂培养基即用型平板（批号：17011502）、沙氏葡萄糖琼脂培养基即用型平板（批号：16121602），购自于济南百博生物技术股份有限公司。

1.2.2 菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]（批号：160510）、大 肠 埃 希 菌[CMCC(B)44102]（ 批 号：160705）、 生 孢梭 菌[CMCC(B)64941]（ 批 号：161223）、 白 色 念 珠 菌[CMCC(F)98001]（批号：160830），购自于北京三药科技开发公司的定量菌珠。

1.2.3 稀释液

0.9%无菌氯化钠溶液。

1.2.4 培养容器

试管、锥形瓶等。

2.试验方法

2.1 方法设计

按照2015年版药典规定，根据该产品性状，宜选择直接接种法进行该产品的无菌试验方法设计，具体参数设计如下。

2.1.1 检验数量

试验组10套；阳性对照组1套。

2.1.2 检验量

剪取约1cm×3cm大小。

2.1.3 阳性对照菌株

金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌。

2.1.4 阴性对照

取相应稀释液同法操作，作为阴性对照。

2.1.5 供试品处理及接种培养基

以无菌操作的方式剪取供试品约1cm×3cm大小，直接接种培养基。

2.1.6 培养基容器、用量及高度

本研究拟采用增大培养基用量的方式以期消除该产品中银离子的抑菌作用。通过方法适用性试验最终确定培养基容器、用量及高度。拟设计系列培养基用量梯度为40mL（φ30mm×200mm试管，培养基高度9cm）、100mL（250mL锥形瓶，培养基高度4.5cm）、200mL（500mL锥形瓶，培养基高度5.5cm）。

2.2 方法适用性试验

2.2.1 菌液制备

按照菌珠说明书进行操作，将菌珠加至10mL0.9%无菌氯化钠溶液，制成每1mL含菌数不大于100 cfu的菌悬液。对制备的菌液进行活菌计数以确认其浓度符合要求。

2.2.2 方法适用性试验

2.2.2.1试验一：40mL培养基

取装有40mL的硫乙醇酸盐流体培养基6管，分别接入不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管。其中1管再接入按照2.1.5处理的供试品，另1管作为对照。置于30～35°C培养不超过5d。

取装有40mL的胰酪大豆胨液体培养基6管，分别接入不大于l00cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管再接入按照2.1.5处理的供试品，另1管作为对照。置于20～25°C培养不超过5d。

2.2.2.2 试验二：100mL培养基

取装有100mL培养基的锥形瓶按照2.2.2.1操作。

2.2.2.3 试验三：200mL培养基

取装有200mL培养基的锥形瓶按照2.2.2.1操作。

3.试验结果

按照中华人民共和国药典2015年版四部通则1101无菌检查法进行结果判断，试验结果见表1～表3。

由表1、表2、表3可知，与相应的对照管比较，40mL含供试品各容器中的试验菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌和枯草芽孢杆菌均生长良好，白色念珠菌和黑曲霉生长微弱、缓慢或不生长，说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用；100mL含供试品各容器中的试验菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均生长良好，黑曲霉生长微弱、缓慢或不生长，说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用；200mL含供试品各容器中的试验菌均生长良好，说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计。

表2.藻酸钙银离子抑菌敷料无菌方法适用性试验结果(100mL)

表3.藻酸钙银离子抑菌敷料无菌方法适用性试验结果(200mL)

4.讨论

本研究采用直接接种法，通过增大培养基量，扩大培养体系，从而消除银对微生物生长的抑制作用。通过实验发现该产品对白色念珠菌和黑曲霉的抑制作用强于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌和枯草芽孢杆菌，最终确定约1cm×3cm大小的检验量在200mL培养体系下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计。无菌检查的供试品接种方法有两种，直接接种法和薄膜过滤法。医疗器械不同于药品，大部分是不溶性的，若采用薄膜过滤法，则涉及到洗脱率问题，故最适宜的接种方法应为直接接种法。采用扩大培养体系的方法可解决具有抑菌作用医疗器械的无菌检查问题。